《Fermentation》：Characterization and Evaluation of Apple Pomace Extract as a Fermentable Substrate in Water Kefir
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水开菲尔是一种由多样化微生物联合体发酵生产的饮品，该联合体能够适应不同的底物来源，从而改变饮品的理化和功能特性。苹果渣是一种农工业副产品，含有可增强微生物活性并影响代谢产物生成的营养物质和化合物，进而引起后续的理化和植物化学变化。本研究以苹果渣提取物作为水开菲
水开菲尔是一种由多样化微生物联合体发酵生产的饮品，该联合体能够适应不同的底物来源，从而改变饮品的理化和功能特性。苹果渣是一种农工业副产品，含有可增强微生物活性并影响代谢产物生成的营养物质和化合物，进而引起后续的理化和植物化学变化。本研究以苹果渣提取物作为水开菲尔在30 °C条件下发酵120 h的底物，评估了总糖含量、pH、总多酚、抗氧化活性、微生物生长、有机酸和挥发性化合物的变化。结果表明，不同底物在发酵过程中存在显著差异。以苹果渣提取物为底物的发酵过程降低了总糖、pH和总多酚含量，同时提高了抗氧化活性和微生物生长量。在以苹果渣提取物为底物的发酵中，检测到乙酸、乳酸、苹果酸和柠檬酸等有机酸，以及乙醇、异丁醇、异戊醇和乙酸乙酯等挥发性化合物，凸显了水开菲尔微生物联合体在发酵过程中的代谢活性。苹果渣被证明是水开菲尔发酵的适宜底物，因为它促进了微生物生长和代谢产物生成；因此，它可作为开发具有潜在功能特性发酵饮品的替代方案。
一、研究背景与研究意义
随着消费者对具有健康功效食品需求的日益增长，功能性食品尤其是发酵食品的生产和消费持续增加。水开菲尔是一种益生菌非乳制品发酵饮品，具有抗菌、抗炎、抗氧化、保肝和抗糖尿病等多种健康功效。水开菲尔传统上通过糖溶液与由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌组成的微生物联合体发酵制成。该联合体具有多样性、动态性和地域依赖性，因此发酵过程中生成的化合物种类和数量取决于培养物、底物来源和工艺条件，导致饮品呈现不同的感官和植物化学特征。
苹果渣是苹果汁和苹果酒加工工业的主要副产品，约占原始果实质量的25%–30%，含有66.4%–78.2%的水分和9.5%–22.0%的碳水化合物，易于发酵但难以处理。苹果渣富含多种植物化学物质，包括单糖、多糖、膳食纤维、多酚、必需脂肪酸、矿物质和天然抗氧化剂。这些可发酵糖和生物活性化合物的存在使苹果渣成为水开菲尔发酵的理想底物。然而，以往研究虽然探索了苹果渣的发酵利用，但未评估其作为唯一底物对发酵过程中饮品物理、化学和微生物学性质的影响，而这对于工艺决策至关重要。因此，本研究旨在评估苹果渣提取物作为底物对水开菲尔谷物发酵动态的影响，重点关注与传统水开菲尔相比的微生物生长、代谢产物生成和理化变化。
二、研究内容与主要结论
研究人员从墨西哥奇瓦瓦州当地企业获得苹果渣副产品，经干燥、粉碎和过筛后制备苹果渣粉末，并通过高温高压处理、离心和过滤获得苹果渣提取物。水开菲尔谷物经活化后，分别以苹果渣提取物和5%蔗糖溶液作为底物，在30 °C、50 rpm条件下发酵120 h，每24 h取样分析。研究发现，苹果渣提取物作为底物时，总糖含量从49.51 ± 1.93 g GE/L降至17.29 ± 1.52 g GE/L，降幅达65.06%，显著高于蔗糖溶液的32.47%降幅。pH方面，苹果渣提取物从初始4.43 ± 0.09降至约3.52后保持稳定，而蔗糖溶液从6.65 ± 0.21持续降至2.57 ± 0.35。总多酚含量在苹果渣提取物中从242.94 ± 9.56 mg GAE/L降至184.34 ± 10.95 mg GAE/L，而蔗糖溶液从3.28 ± 1.20 mg GAE/L增至60.12 ± 0.98 mg GAE/L。抗氧化活性在两种底物中均显著增加，苹果渣提取物从638.7 μmol TE/L增至约854.18 μmol TE/L，蔗糖溶液从20.85 ± 1.61增至53.94 ± 4.48 μmol TE/L，最终两种底物间差异达93.62%。微生物生长方面，苹果渣提取物中酵母菌在120 h时达到7.14 ± 0.27 log CFU/mL，醋酸菌在24 h时达到7.56 ± 0.08 log CFU/mL，均高于蔗糖溶液。有机酸分析显示，苹果渣提取物中乙酸从不可检测水平升至4508.8 ± 397.2 mg/L，乳酸在120 h时达到68.2 ± 10.8 mg/L，苹果酸从1330.6 ± 85.4 mg/L降至968.0 ± 97.1 mg/L后回升至1105.0 ± 32.4 mg/L，柠檬酸从769.9 ± 64 mg/L降至163.9 ± 12.7 mg/L。挥发性化合物方面，苹果渣提取物发酵产生了乙醇、乙酸乙酯、异丁醇、异戊醇和乙酸等化合物，其中乙醇在72 h时达到最大值36,972 ± 1309 mg/L。
三、主要技术方法
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：苹果渣经热风干燥、粉碎和过筛后，以10% w/v悬浮于自来水中，在120 °C、10 PSI条件下高压处理40 min，经离心和真空过滤获得提取物。水开菲尔谷物以50 g/L接种量分别加入苹果渣提取物和5%蔗糖溶液中，在30 °C、50 rpm摇床培养箱中发酵120 h，每24 h取样分析。理化分析包括pH测定和苯酚-硫酸法总糖测定；微生物计数采用表面滴板法分别对酵母菌、乳酸菌和醋酸菌进行培养计数；总多酚采用Folin–Ciocalteu法测定；抗氧化活性采用DPPH自由基清除法测定；有机酸采用高效液相色谱法分析；挥发性化合物采用静态顶空气相色谱-质谱联用法分析。实验采用6 × 2因子完全随机设计，每组三次重复。
四、研究结果
4.1 苹果渣的理化特性
苹果渣干重基础近似组成为：蛋白质3.57 ± 0.05%、脂肪2.65 ± 0.10%、灰分1.94 ± 0.02%、纤维11.22 ± 0.07%、碳水化合物61.69 ± 5.47%。苹果渣提取物的pH为4.43 ± 0.09，总糖含量49.51 ± 1.93 g GE/L，总酚242.94 ± 9.56 mg GAE/L，抗氧化活性638.7 ± 25.9 μmol TE/L。提取物中检测到苹果酸1330.6 ± 85.4 mg/L和柠檬酸769.9 ± 64.0 mg/L，挥发性化合物包括己醛、苯甲醛和苯乙酸，但浓度过低无法可靠定量。
4.2 总糖含量与pH
两种底物在发酵过程中总糖含量和pH均显著下降。苹果渣提取物总糖降幅达65.06%，显著高于蔗糖溶液的32.47%。蔗糖溶液pH从6.65 ± 0.21持续降至2.57 ± 0.35，而苹果渣提取物pH从4.43 ± 0.09降至约3.52后保持稳定，两种底物在120 h时相差0.94个单位。
4.3 总酚含量与抗氧化活性
苹果渣提取物中总多酚从242.94 ± 9.56 mg GAE/L降至184.34 ± 10.95 mg GAE/L，蔗糖溶液则从3.28 ± 1.20增至60.12 ± 0.98 mg GAE/L。抗氧化活性在两种底物中均显著增加，苹果渣提取物最终值约为854.18 μmol TE/L，蔗糖溶液为53.94 ± 4.48 μmol TE/L，底物间差异达93.62%。
4.4 微生物生长
苹果渣提取物中酵母菌在120 h时达到7.14 ± 0.27 log CFU/mL，醋酸菌在24 h时达到7.56 ± 0.08 log CFU/mL后逐渐下降至5.64 ± 0.41 log CFU/mL。蔗糖溶液中酵母菌在48 h达到峰值6.50 ± 0.09 log CFU/mL后下降至5.44 ± 0.27 log CFU/mL，醋酸菌在24 h达到6.79 ± 0.11 log CFU/mL后保持稳定。在MRS培养基上回收的菌落经鉴定为革兰氏阴性、过氧化氢酶阳性，不具备乳酸菌典型特征，因此未报告乳酸菌计数。
4.5 有机酸
苹果渣提取物发酵中，乙酸从不可检测水平升至4508.8 ± 397.2 mg/L，乳酸在120 h时达到68.2 ± 10.8 mg/L，苹果酸从1330.6 ± 85.4 mg/L降至968.0 ± 97.1 mg/L后回升至1105.0 ± 32.4 mg/L，柠檬酸从769.9 ± 64 mg/L降至163.9 ± 12.7 mg/L。蔗糖溶液中乙酸在48 h后出现，乳酸仅在120 h后出现，但浓度过低无法定量。
4.6 挥发性化合物
苹果渣提取物发酵24 h后检测到乙酸乙酯、乙醇8909 ± 204 mg/L、异丁醇2.31 ± 0.04 mg/L、异戊醇43.59 ± 1.63 mg/L和4-戊烯-1-醇。72 h时各化合物浓度增加，乙醇达36,972 ± 1309 mg/L，并出现乙酸5263 ± 741 mg/L和2-苯乙醇。120 h时各化合物浓度下降，乙醇降至24,346 ± 3243 mg/L，乙酸降至2061 ± 159 mg/L，并出现丙酸。蔗糖溶液在72 h才开始检测到挥发性化合物，主要为乙醇和苯甲酸、苯乙酸，120 h时乙酸为1100.51 ± 175.20 mg/L。
五、讨论与结论
讨论部分指出，苹果渣提取物中总糖的显著下降归因于微生物代谢活动，酵母菌和细菌通过产生蔗糖酶、葡萄糖苷酶等酶类水解蔗糖、葡萄糖和果糖。苹果渣提取物pH的稳定性可能归因于其中苹果酸和柠檬酸等有机酸提供的缓冲能力。总多酚含量的下降可能是微生物利用多酚作为底物所致，而蔗糖溶液中多酚的上升可能源于蔗糖水解产生的还原糖对Folin–Ciocalteu法的干扰。抗氧化活性的增加可能与微生物酶释放结合态多酚及糖苷态多酚转化为苷元形式有关。微生物生长方面，苹果渣提取物中较高的酵母菌和醋酸菌计数归因于其丰富的营养成分，包括单糖、果胶、纤维素、矿物质和氨基酸等。乙酸的产生主要通过醋酸菌对乙醇的有氧氧化实现，乳酸则通过糖酵解途径生成。挥发性化合物中，乙醇是最丰富的化合物，其含量先增后降，下降归因于醋酸菌将其氧化为乙酸以及挥发损失。
研究结论表明，苹果渣作为苹果汁和苹果酒加工工业的副产品，经预处理后可有效用作水开菲尔发酵的底物。以苹果渣提取物发酵水开菲尔比糖溶液表现出更高的微生物生长量，包括酵母菌和醋酸菌。发酵过程中总糖含量逐渐下降和pH降低表明底物被消耗并产生有机酸，主要是乙酸。苹果渣发酵产生的酚类化合物含量和抗氧化活性均高于糖溶液，改善了水开菲尔产品的品质。此外，发酵产生了多种挥发性化合物和有机酸，包括乙酸乙酯、乙醇、异丁醇、异戊醇、乳酸和乙酸，表明苹果渣提取物化学特征的复杂性和浓度均更高。这些发现表明，苹果渣提取物可作为水开菲尔发酵的替代底物，支持开发具有多样化化学和微生物特性的发酵饮品或产品，同时促进农工业副产品的增值利用。
