孤儿G蛋白偶联受体GPR88的去孤儿化：C1ql1桥联GPR88与黏附G蛋白偶联受体BAI3形成跨突触复合体维持小脑爬行纤维-浦肯野细胞突触完整性

《SCIENCE ADVANCES》：Trans-synaptic interaction of orphan GPCR GPR88 and adhesion GPCR BAI3 through C1ql1 maintains synapse integrity

　　

GPR88是一种孤儿G蛋白偶联受体（orphan GPCR），其遗传变异与多种神经精神疾病相关。GPR88在纹状体（striatum）、嗅结节（olfactory tubercle）和下橄榄（inferior olive）中呈富集表达。尽管存在这些功能相关性，其内源性配体及下游分子通路仍未明确。研究人员发现，定位于爬行纤维（climbing fiber, CF）的GPR88调控小脑CF–浦肯野细胞（Purkinje cell, PC）突触及联想学习行为。研究结果支持CF分泌蛋白C1ql1作为GPR88的配体，并进一步揭示C1ql1激活偏向性G_q信号以增强CF突触。最后，研究人员在体外证明GPR88锚定C1ql1，并通过C1ql1与突触后黏附G蛋白偶联受体（adhesion GPCR）BAI3形成三联体复合物。这些发现解决了GPR88的孤儿受体身份问题，并可能揭示一种由分泌蛋白连接两个GPCR以在突触前和突触后位点精细调节突触信号的机制。

研究背景：G蛋白偶联受体（GPCR）是神经精神疾病的重要治疗靶点；A类GPCR中大量孤儿受体（内源性配体未明）的中枢功能未解。GPR88为A类孤儿GPCR，富集于纹状体、嗅结节和下橄榄（inferior olive, IO），其突变与精神分裂症、双相障碍和智力障碍相关；全身Gpr88缺失导致多动、焦虑降低和运动学习缺陷，纹状体Gpr88缺失影响运动与认知，但其配体和分子机制未明。黏附GPCR（adhesion GPCR）参与轴突导向、突触发生与环路精修；BAI3在浦肯野细胞（Purkinje cell, PC）中缺失降低爬行纤维（climbing fiber, CF）–PC突触密度，突触后BAI3结合CF分泌的C1ql1，但黏附GPCR激活的突触前信号未知。因此，研究人员探究GPR88的内源配体、突触前后定位及其在突触发育和维持中的作用。

研究概况与意义：研究人员以条件遗传、形态与电生理、行为学、配体筛选及体外重构发现：CF终末GPR88维持CF–PC突触完整性及橄榄小脑环路联想学习；C1ql1为GPR88配体，激活偏向性G_q信号增强CF突触；GPR88经C1ql1与突触后BAI3形成三联体复合物。该研究使GPR88去孤儿化，揭示分泌蛋白连接两个GPCR、在突触前后精细调节突触信号的机制，对突触功能障碍相关神经发育、神经退行和神经精神疾病具提示意义。论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。

关键技术方法：采用囊泡谷氨酸转运体2（vGluT2）-Cre;Gpr88^fl/fl条件敲除、HA-Gpr88^fl/fl敲入、C1ql1^?/?与HA-C1ql1敲入小鼠（Gpr88^fl/fl源自B. Kieffer实验室，C1ql1^?/?和HA-C1ql1敲入源自D. C. Martinelli实验室）；结合IO立体定位腺相关病毒（AAV）、电镜、全细胞膜片钳、结构光照明显微镜（SIM）、小脑肽注射、眨眼条件化及行为学；体外采用人工突触形成、细胞表面结合/聚集、G蛋白解离、生物发光共振能量转移（BRET）、异硫氰酸荧光素（FITC）配体竞争结合、单细胞钙成像和分子动力学（MD）模拟。

主要研究结果：
1. GPR88维持突触完整性和联想学习（GPR88 maintains synaptic integrity and associative learning）：vGluT2⁺神经元条件敲除Gpr88降低小脑CF终末vGluT2阳性斑点和突触结构，降低CF诱发的兴奋性突触后电流（EPSC）振幅并改变量子释放及γ-DGG下双脉冲比（PPR）；平行纤维–PC传递和微小抑制性突触后电流（mIPSC）基本不变；成年IO注射AAV-Cre亦降低CF突触维持和CF-EPSC。突变鼠无运动、焦虑、社交和注意异常，但眨眼条件化条件反应概率降低、获得延迟，消退完整且再获得持续缺陷。结论：IO神经元GPR88对CF–PC突触维持和联想学习必需。
2. GPR88定位于CF终末（GPR88 localizes at CF terminals）：HA-Gpr88^fl/fl敲入显示小脑分子层CF信号于vGluT2;HA-Gpr88^fl/fl消失；SIM显示GPR88位于vGluT2阳性簇内、距活性带中心约250 nm；AAV介导IO重表达GPR88-ALFA恢复vGluT2斑点密度并与vGluT2共定位。结论：GPR88为CF突触前组织组分。
3. GPR88 N端为体外突触发生所需（The N terminus of GPR88 is required for synaptogenesis in vitro）：HEK293T–海马神经元人工突触实验显示GPR88选择性招募兴奋性突触后密度蛋白95（PSD95），不诱导其他突触类型；ΔN21消除该作用，ΔC29无影响。结论：GPR88依赖N端促进兴奋性突触后分化。
4. C1ql1是GPR88的配体（C1ql1 is a ligand of GPR88）：经单细胞RNA测序共表达分析、IO差异基因筛选、细胞表面结合和聚集实验，发现C1ql1直接结合GPR88；C1ql1激活GPR88偶联的G_q与G_i1，AA36-52片段激活G_q；N端为激活而非结合所需；FITC-C1ql1(AA36-52)饱和/竞争结合获得参数；基于荧光砷结合hairpin（FlAsH）的BRET显示配体诱导GPR88 N端与胞外环1/2（ECL1/ECL2）构象分离。结论：C1ql1为GPR88配体并激活G_q/G_i1。
5. C1ql1经偏向性GPR88/G_q激活增强CF突触连接（Biased GPR88/Gq activation by C1ql1 boosts CF synaptic connectivity）：C1ql1 AA1-52和AA163-216选择性激活G_q及钙升高，AA217-258激活G_i1；MD模拟显示GPR88–C1ql1(AA36-52)界面稳定，关键残基突变影响结合和G_q活性；小脑内注射AA1-52增强CF突触形成，AA217-258无作用，该增强在GPR88缺失时被取消；G_q抑制剂YM-254890降低CF突触密度；Gpr88/C1ql1双敲除（dKO）较C1ql1^?/?无叠加缺陷。结论：C1ql1 N端驱动的G_q激活对维持CF突触密度关键，二者处于同一通路。
6. GPR88锚定C1ql1并经C1ql1与BAI3形成三联体复合物（GPR88 anchors C1ql1 and forms a tripartite complex with BAI3 and C1ql1）：Gpr88条件缺失降低CF终末C1ql1富集而总C1ql1不变；SIM显示C1ql1纳米簇横向移位、距vGluT2中心增加而数目不变；细胞表面结合显示GPR88仅在C1ql1存在时结合BAI3-CUB，pull-down实验显示GPR88、C1ql1和BAI3-CUB形成三元复合物。结论：GPR88锚定C1ql1并形成GPR88/C1ql1/BAI3跨突触复合体。

讨论与结论：讨论指出，GPR88短N端足以影响突触发生；小脑CF中GPR88呈突触前组织者作用，而纹状体/IO胞体树突定位提示不同机制。C1ql1激活GPR88-G_q提供突触前信号，并与突触后BAI3经C1ql1形成“夹心样”跨突触复合体，可能优化信号转导而非产生机械力；MD提示界面动态灵活。C1ql1主要富集于IO，C1ql2/C1ql3不激活GPR88，提示纹状体GPR88可能存在不同内源伙伴；C1ql1释放机制、复合物在体动态及是否组成性激活仍待研究。研究结论翻译：研究人员获得三项主要结论：第一，小脑CF终末的孤儿GPCR GPR88对CF–PC突触维持及橄榄小脑环路联想学习必需；第二，C1ql1为GPR88配体，并在体外激活GPR88偶联的G_q信号、增加小脑CF突触密度；第三，GPR88通过C1ql1与突触后黏附GPCR BAI3相互作用并在体外形成跨突触复合体。该研究使GPR88去孤儿化，揭示GPR88–C1ql1–BAI3这一对突触连接必需的GPCR伙伴关系，定义了一个此前未识别的、为突触功能和行为所需的信号轴。