《iScience》：TXNIP/p-PRKAA promotes ferroptosis through the BECN1/SLC7A11 signaling pathway in intestinal ischemia/reperfusion injury
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铁死亡（Ferroptosis）已成为肠缺血再灌注（I/R）损伤中的关键因素。尽管BECN1已被认为是I/R损伤进展中的重要因子，但其在肠I/R损伤期间铁死亡中的作用仍未被充分阐明。在本研究中，研究人员建立了肠I/R损伤的体内模型以及Caco-2细胞中氧-葡萄
铁死亡（Ferroptosis）已成为肠缺血再灌注（I/R）损伤中的关键因素。尽管BECN1已被认为是I/R损伤进展中的重要因子，但其在肠I/R损伤期间铁死亡中的作用仍未被充分阐明。在本研究中，研究人员建立了肠I/R损伤的体内模型以及Caco-2细胞中氧-葡萄糖 deprivation/再氧合（OGD/R）的体外模型。研究结果表明，铁死亡显著促进了肠组织损伤和细胞死亡的加重。BECN1表达水平升高。通过过表达或沉默BECN1，研究人员观察到活化的BECN1通过靶向SLC7A11促进OGD/R期间的铁死亡。此外，TXNIP/p-PRKAA通过BECN1/SLC7A11通路调控I/R期间的铁死亡。最后，体内TXNIP敲除通过BECN1/SLC7A11通路抑制了铁死亡并减轻了肠I/R损伤。总之，本研究强调了TXNIP/p-PRKAA通过与BECN1/SLC7A11相互作用调控铁死亡的关键作用。TXNIP和BECN1是潜在的治疗靶点。
研究背景与科学问题
肠缺血再灌注（I/R）损伤是多种危重疾病和器官损伤中常见的病理生理过程，其病因包括严重失血、感染、创伤及失血性休克等导致的低血容量状态。此外，小肠移植、肠梗阻矫正及体外循环等腹部手术也可能导致肠道血供突然减少，即急性肠系膜缺血（AMI）。尽管过去20年间手术技术和术后护理取得显著进步，肠I/R患者的预后仍然不佳，发生多器官功能障碍综合征（MODS）的患者死亡率高达67%至80%。因此，围手术期肠道保护具有重大临床需求。
铁死亡（Ferroptosis）是一种由Dixon于2012年发现的铁介导的细胞死亡形式，以脂质过氧化物大量积累为特征。在细胞水平上，缺血主要表现线粒体结构的明显改变，包括线粒体总体积缩小、膜增厚以及外膜偶发破裂，线粒体内嵴减少或完全消失，而细胞核大小通常不变。正常生理条件下，细胞膜通过Fe2?介导的酶促和非酶促反应产生脂质过氧化物，随后由细胞内抗氧化系统将其还原为无害醇类。当脂质过氧化物过量产生并超过细胞还原能力时，即发生膜损伤。
BECN1已知与多种伴侣蛋白相互作用以调节细胞功能，包括内吞、细胞周期和凋亡。近年来，BECN1被证明以自噬依赖和自噬非依赖两种方式调控铁死亡。研究人员前期工作证实肠I/R损伤期间自噬过程中BECN1水平升高，但其在肠I/R损伤铁死亡中的确切作用仍不清楚。
硫氧还蛋白还原酶系统是人体内两大主要的硫醇还原系统之一，由硫氧还蛋白（TRX）、TRX还原酶、硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）组成。TXNIP作为TRX活性的内源性抑制剂，通过结合TRX抑制其活性。近期研究表明TXNIP是肝细胞癌、肺腺癌干细胞及肾小管上皮细胞铁死亡的关键调控因子，但TXNIP在肠I/R损伤中的功能研究甚少。
研究内容与主要结论
本研究通过体内肠I/R模型和Caco-2细胞氧-葡萄糖剥夺/再氧合（OGD/R）体外模型，系统验证了TXNIP/p-PRKAA通过BECN1/SLC7A11信号通路调控肠I/R损伤中铁死亡的机制。研究首次在肠I/R模型中验证了该通路，并确定TXNIP/p-PRKAA为BECN1/SLC7A11的上游调控节点，提示TXNIP和BECN1可作为减轻I/R肠组织损伤和预防铁死亡的潜在治疗靶点。
关键技术方法
研究人员通过数据库检索获得肠I/R相关靶基因并与FerrDb铁死亡数据库交叉分析，利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，采用ZDOCK进行蛋白质结构对接分析，通过免疫荧光共定位和免疫共沉淀（CoIP）验证蛋白质相互作用。动物实验采用C57BL/6小鼠和TXNIP基因敲除（TXNIP?/?）小鼠建立肠I/R模型，细胞实验采用Caco-2细胞系建立OGD/R模型，运用Western blot、HE染色、透射电镜（TEM）及生化检测等手段评估铁死亡相关指标。
研究结果
铁死亡在体内发生，抑制铁死亡可减轻肠I/R损伤。数据库筛选获得1,468个靶基因，GO和KEGG富集分析显示这些基因涉及脂质、质膜和氧化应激过程。I/R组小鼠肠组织病理损伤和Chiu评分显著高于Sham组，血清二胺氧化酶（DAO）升高，紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达降低，铁死亡抑制因子GPX4和SLC7A11水平下降，铁死亡标志物MDA、Fe2?、T-GSH及GSH/GSSG比值显著升高，线粒体嵴数量减少。给予铁死亡抑制剂liproxstatin-1后上述效应显著减轻。
铁死亡在体外发生，抑制铁死亡可减轻OGD/R损伤。Caco-2细胞经4小时氧-葡萄糖剥夺和4小时再氧合后，GPX4和SLC7A11表达降低，MDA、4-HNE、T-GSH、GSH/GSSG比值及Fe2?浓度升高，ZO-1和Occludin水平下降，liproxstatin-1处理后上述效应得到缓解。
BECN1与SLC7A11在OGD/R后发生相互作用。通过交叉分析肠I/R靶基因与铁死亡相关数据库，鉴定出166个关键基因，其中包括BECN1。BECN1在肠I/R模型和OGD/R细胞模型中表达均升高。STRING数据库显示BECN1与SLC7A11存在强相关性，ZDOCK分析显示二者相互作用能为?42.9 kcal/mol，提示复合物稳定。免疫荧光双标证实OGD/R后两种蛋白共定位，CoIP确认了BECN1/SLC7A11复合物的形成。
BECN1是OGD/R后体外实验中的关键因子。过表达BECN1后，ZO-1和Occludin表达进一步降低，GPX4和SLC7A11表达下降，MDA、4-HNE、T-GSH、GSH/GSSG比值及Fe2?浓度进一步升高。敲低BECN1后上述铁死亡标志物水平降低，GPX4和SLC7A11表达恢复，ZO-1和Occludin表达相对增加。
TXNIP与PRKAA发生相互作用。通过PhosphoSitePlus数据库预测p-PRKAA介导BECN1在高度保守的Ser90、Ser93、Ser96和Thr388位点的磷酸化。STRING数据库显示TXNIP与PRKAA存在中等相关性，ZDOCK分析显示二者相互作用能为?22.6 kcal/mol，复合物稳定。免疫荧光双标证实OGD/R后TXNIP与p-PRKAA共定位，CoIP确认了TXNIP/p-PRKAA复合物的形成。
TXNIP在体外促进铁死亡。OGD/R组TXNIP、p-PRKAA和p-BECN1水平较对照组升高。过表达TXNIP后，p-PRKAA和p-BECN1水平进一步升高，GPX4表达进一步降低，MDA、4-HNE、T-GSH、GSH/GSSG比值及Fe2?浓度升高，ZO-1和Occludin表达进一步降低，SLC7A11表达下调。
TXNIP敲低通过p-PRKAA在体外减少铁死亡和损伤。TXNIP敲低组p-PRKAA和p-BECN1水平较OGD/R组降低，抑制PRKAA表达可降低p-BECN1水平。TXNIP敲低组MDA、4-HNE、T-GSH、GSH/GSSG比值及Fe2?浓度降低，GPX4表达升高，ZO-1和Occludin表达增加，SLC7A11表达恢复。
TXNIP/p-PRKAA在体内通过BECN1/SLC7A11减轻肠I/R铁死亡。TXNIP基因敲除小鼠（KO-I/R组）较野生型I/R小鼠（WT-I/R组）肠组织损伤减轻，Chiu评分降低，血清DAO水平下降，ZO-1和Occludin表达恢复，MDA、Fe2?、T-GSH、4-HNE及GSH/GSSG比值显著降低，p-PRKAA和p-BECN1水平下降，SLC7A11和GPX4表达恢复。
讨论与结论
肠道是富含血管的器官，对缺血和再灌注高度敏感。肠缺血损伤患者死亡率极高，AMI早期发现死亡率约30%，重症监护室患者30天死亡率可高达71%。肠I/R损伤涉及多种细胞死亡机制，包括凋亡、焦亡、自噬和坏死性凋亡。本研究观察到肠I/R期间发生铁死亡，抑制铁死亡可显著减轻肠损伤。
BECN1通过与SLC7A11形成复合物抑制SLC7A11表达从而促进铁死亡。系统Xc?是由跨膜转运蛋白SLC7A11和跨膜调节蛋白SLC3A2组成的异二聚体，通过将胞内谷氨酸输出和胞外胱氨酸输入来维持氧化还原稳态。BECN1作为自噬过程的关键因子，可通过铁蛋白吞噬（ferritinophagy）增加胞内铁水平促进铁死亡，也可通过非自噬机制与SLC7A11相互作用抑制系统Xc?功能。本研究发现肠I/R铁死亡中BECN1通过降低SLC7A11表达水平抑制系统Xc?功能。
BECN1需要多种激酶磷酸化以执行其功能。TXNIP和PRKAA在肠I/R介导的自噬中高表达，被确定为铁死亡的潜在调控因子。TXNIP促进PRKAA磷酸化，与糖尿病视网膜病变和猪肝脏循环死亡中的发现一致。值得注意的是，有报道指出AMPK在能量应激下通过ACC磷酸化和脂质代谢抑制铁死亡，与本研究结果相反；而另一报道表明PRKAA/AMPKα在铁死亡中BECN1磷酸化不可或缺。这些差异提示AMPK活性可能因条件、疾病模型、应激刺激性质、细胞系或特定上下游信号环境而异。
研究结论：肠I/R损伤期间，活化的TXNIP可能形成TXNIP/PRKAA复合物，增加BECN1磷酸化水平，促进BECN1/SLC7A11复合物形成，抑制SLC7A11转运功能，从而促进铁死亡。抑制TXNIP和BECN1可能增强I/R损伤后肠道的抗铁死亡能力，减轻肠道损伤并保护肠黏膜屏障。TXNIP和BECN1是治疗肠I/R损伤的潜在靶点。
研究局限性：第一，肠I/R损伤期间BECN1的磷酸化位点尚不清楚；第二，BECN1降低SLC7A11蛋白水平的机制尚未深入研究，这是未来的研究方向；第三，缺乏临床样本验证，未来需要分析人类肠I/R样本。
