《Colloids and Interfaces》：PVA-Stabilized Biogenic Selenium Nanoparticles: Physicochemical Properties and Ultrastructural Responses in Human Dermal Fibroblasts
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生物源硒纳米颗粒（SeNPs）具有有前景的生物医学特性，但聚合物环境可影响其理化稳定性及细胞相互作用。本研究将采用*Amphipterygium glaucum*叶提取物合成的SeNPs复合入中分子量聚乙烯醇（PVA）基质，获得可再分散的SeNPs@PVA89
生物源硒纳米颗粒（SeNPs）具有有前景的生物医学特性，但聚合物环境可影响其理化稳定性及细胞相互作用。本研究将采用*Amphipterygium glaucum*叶提取物合成的SeNPs复合入中分子量聚乙烯醇（PVA）基质，获得可再分散的SeNPs@PVA89纳米复合物。光谱、结构、形貌、热学及分散性分析显示，SeNPs的引入保留了特征性纳米尺度与光学特征，同时改变聚合物组织。流体动力学直径由153 nm增至320 nm，ζ电位由?53 mV变为?22 mV，这与纳米颗粒界面环境变化及水化PVA层相一致。在人真皮成纤维细胞（HDF）中，SeNPs@PVA89诱导浓度依赖性效应：3和6 μg/mL时代谢活性得以保持，而≥12 μg/mL显著降低细胞活力；3 μg/mL时，形态、F-actin组织及伤口闭合得以保持。然而，共聚焦显微镜显示点状胞内荧光，透射电子显微镜（TEM）显示膜结合囊泡内电子致密物质，同时伴线粒体片段化、嵴改变及粗面内质网重塑。尽管这些电子致密结构的元素身份未直接确认，但研究结果与纳米系统的细胞相互作用及囊泡隔离相一致。总体而言，PVA稳定化生物源SeNPs表现出浓度依赖性细胞效应，尽管常规细胞相容性结果未改变，仍出现超微结构重塑。
研究背景与意义：硒纳米颗粒（SeNPs）因纳米尺度及表面反应性而可与生物系统相互作用，并具抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌等生物医学潜力；相较常规无机和有机硒化合物，SeNPs在适当暴露条件下可能具有更宽治疗窗和较低毒性，但其生物学表现高度依赖粒径、表面化学、聚集状态和稳定环境。植物介导生物合成可利用植物代谢物作为还原剂和表面封端剂，*Amphipterygium glaucum*提取物中的多酚、黄酮、萜类、蛋白质和多糖等可参与纳米颗粒形成并吸附于表面，影响分散性、表面电荷和生物相互作用；但生物源纳米颗粒在加工、储存及生物环境暴露中仍易发生聚集、氧化和分散性变化。聚乙烯醇（PVA，亲水性生物相容性聚合物）可通过羟基和空间作用调控纳米颗粒界面环境，影响流体动力学尺寸、表面电荷、聚集行为及聚合物链组织。然而，聚合物介导稳定化、理化行为与正常人成纤维细胞早期超微结构响应之间的关系尚不充分；基于代谢活性、形态、细胞骨架和迁移的常规实验可评估整体细胞功能，但可能无法检测纳米颗粒暴露后的早期亚细胞响应。因此，研究人员制备SeNPs@PVA89纳米复合物，并整合理化表征与代谢活性、伤口闭合、细胞骨架、荧光及超微结构评价，以考察其与人真皮成纤维细胞（HDF）的相互作用。研究结论表明，PVA稳定化生物源SeNPs呈浓度依赖性细胞效应；在3 μg/mL下常规功能指标大体保留，但TEM仍见超微结构重塑，提示常规细胞相容性终点不一定排除亚细胞响应，需将超微结构分析作为功能实验的补充。其意义在于为聚合物稳定化生物源纳米颗粒的纳米—生物相互作用评价及面向组织工程的含纳米颗粒生物材料评价提供更全面的实验依据。
关键技术方法概括：生物源SeNPs按Hernández-Díaz等前期方法，以*A. glaucum*叶提取物还原Na
2SeO
3制备；与89 kDa PVA复合、冻干获得SeNPs@PVA89。理化表征采用UV–Vis、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、TEM、动态光散射（DLS）、ζ电位、扫描电子显微镜（SEM）—能量色散X射线光谱（EDS）、X射线衍射（XRD）和差示扫描量热法（DSC）。细胞实验使用人成年真皮成纤维细胞（HDFa；ATCC? PCS-201-012，第7代），开展MTT、体外划痕、共聚焦（内源荧光及F-actin/DAPI染色）和细胞TEM。
研究结果：
3.1 UV–Vis与FTIR光谱：UV–Vis显示游离SeNPs在约275 nm具吸收带，复合入PVA后最大吸收位置无明显位移而强度下降，冻干复溶后UV–Vis谱仍保持，提示加工未明显改变其特征光学响应。FTIR显示PVA的O–H伸缩带由约3283 cm
?1移至3300 cm
?1并变宽，指纹区约1140、1090、843和669 cm
?1等谱带发生变化，提示SeNPs与富羟基PVA基质发生相互作用，并改变聚合物链组织及表面硒物种振动环境。
3.2 SeNPs@PVA89的形貌与胶体表征：TEM显示生物源SeNPs主要呈准球形，102个颗粒直径为11–23 nm，均值14.77 ± 2.47 nm，中位14.0 nm；偶见小簇状组装但无明显广泛聚并。DLS显示流体动力学直径由游离SeNPs约153 nm增至SeNPs@PVA89约320 nm；ζ电位由约?53 mV变为?22 mV，符合水化PVA层及界面环境改变，非一次粒径增大；PVA为非离子聚合物，可提供空间稳定。
3.3 SEM形貌表征：SEM显示冻干SeNPs@PVA89呈多孔三维形貌、互联空腔及层状区域，主要反映冻干加工历史；EDS确认硒及PVA基质碳、氧信号，元素映射显示硒在分析区域分布较均匀，支持SeNPs相关物质在聚合物网络中的有效 incorporation。
3.4 SeNPs掺入PVA引起的结构与热学变化：XRD确认生物源SeNPs的结晶性，单斜晶胞参数为a = 4.9046 ?、b = 9.9897 ?、c = 6.8598 ?、β = 90.26°；PVA89在19.9320°等处具半结晶反射，复合后峰强度降低、约40.9°附近反射明显衰减，提示PVA结晶组织降低。DSC显示PVA89熔融转变约223 °C，SeNPs@PVA89约180 °C，提示晶域稳定性降低，与FTIR和XRD所示氢键环境改变及结晶有序度降低一致。
3.5 SeNPs@PVA89对HDF代谢活性的浓度依赖性效应；3.6 MTT实验：24 h暴露后，3和6 μg/mL组代谢活性约100%和99%，与未处理对照无显著差异；≥12 μg/mL显著降低，12、25、50、100和200 μg/mL分别约22%、23%、38%、24%和13%；3和6 μg/mL与≥12 μg/mL差异显著，高浓度组间多数比较无显著差异。基于此，3 μg/mL被选为后续成像和超微结构分析浓度。
3.7 SeNPs@PVA89对HDF伤口闭合的浓度依赖性效应：划痕实验显示24 h时3 μg/mL组伤口闭合与对照无显著差异；48 h时3 μg/mL组继续渐进闭合且周围单层外观完整。25 μg/mL组虽可见无细胞区减少，但出现细胞脱落；100和200 μg/mL组单层明显破坏、纺锤形形态丧失、细胞收缩及广泛脱落。研究人员指出划痕闭合综合反映迁移、增殖和存活，高浓度下剩余无细胞区不能直接解释为迁移能力改变。
3.8 共聚焦显微镜与F-actin组织：3 μg/mL暴露24 h后，多数HDF保持纺锤形形态、核形态及总体F-actin组织，与对照相近；少数细胞见较细胞质突起和局部F-actin变化，但非群体性，不能作为普遍细胞骨架反应证据。共聚焦显示处理细胞胞质内点状荧光结构，主要分布于核周，对照未见相当信号；无外源荧光探针时SeNPs@PVA89在绿、红、蓝通道均呈点状胞内荧光，合并信号以胞质为主。该结果与SeNPs@PVA89胞内关联相容，但荧光显微镜不能确定荧光结构的元素身份。
3.9 HDF对SeNPs@PVA89的超微结构响应：TEM显示3 μg/mL暴露24 h后，对照HDF核形态正常、线粒体 elongated 且嵴清晰、粗面内质网（RER）组织正常并偶见脂滴；处理组见线粒体片段化、嵴结构破坏、RER池扩张和重排、同心膜结构及膜结合囊泡增多，部分囊泡内含电子致密结构。其形态与纳米颗粒相关物质相容，但元素组成未直接确认，应解释为支持胞内关联和囊泡隔离的形态学证据。线粒体和RER改变与既往报道的纳米颗粒早期细胞应激靶点一致，但本研究未直接测定具体分子机制。关键在于，这些超微结构改变发生于3 μg/mL下MTT代谢活性、伤口闭合和总体F-actin组织大体保留的相同暴露条件，提示常规细胞相容性终点可能不足以反映完整细胞响应。
讨论部分总结：本研究不是仅开发可再分散的PVA稳定化生物源SeNPs配方，而是将理化表征与功能、荧光和超微结构分析结合，显示纳米复合物可在常规实验中表现为细胞相容，同时诱导TEM可检测的超微结构改变。该区别对组织工程尤为重要，因为再生应用生物材料不仅应维持细胞活力和总体功能行为，还应关注亚细胞组织稳态；因此，超微结构评估可补充常规细胞相容性实验，用于界定生物学上更耐受的条件。SeNPs@PVA89的内源多通道荧光使研究人员可在无外源探针条件下观察点状胞内信号，并与TEM观察互补。研究结论翻译如下：采用*A. glaucum*提取物合成的生物源SeNPs成功稳定于中分子量PVA基质中，保留其纳米尺度特征和特征光学响应，同时改变聚合物—纳米颗粒体系的理化环境；光谱、分散、结构、热学和元素分析支持SeNPs@PVA89形成，流体动力学行为、表面电位、聚合物链组织和晶体结构的变化与生物源纳米颗粒表面和PVA基质之间相互作用一致。HDF的生物学响应强烈依赖浓度：3和6 μg/mL时代谢活性保持，≥12 μg/mL时MTT响应显著降低；3 μg/mL时HDF还维持伤口闭合、整体形态和F-actin组织。然而，共聚焦显微镜显示离散胞内荧光，TEM显示线粒体片段化、嵴改变、RER重塑及含电子致密结构的膜结合囊泡腔室；尽管未直接确认这些胞内结构的元素身份，其形态与纳米系统的胞内关联和囊泡隔离一致。这些发现表明，满足常规细胞相容性终点并不一定排除亚细胞响应；在功能耐受暴露条件下检测到的超微结构改变提供了补充代谢、伤口闭合和细胞骨架测定的额外生物学信息。尽管未直接研究潜在机制，此处观察到的线粒体和RER改变可能代表先于明显功能损伤的细胞应激反应。从组织工程角度看，面向再生应用的生物材料不仅应评估细胞活力和总体功能行为，还应评估其对亚细胞组织的影响；SeNPs@PVA89为检查聚合物稳定化生物源纳米颗粒如何与正常人成纤维细胞相互作用提供了有用模型，所采用的理化、功能、荧光和超微结构联合方法为评估面向未来再生应用的含纳米颗粒生物材料提供了更全面的基础。
