标题：苹果二氢查耳酮根皮素处理诱导荠菜（Capsella bursa-pastoris）氧化还原失衡并伴随脂质过氧化

《Horticulturae》：Modulation of Redox Balance in Shepherd’s Purse by the Apple Dihydrochalcone Phloretin

　　

根皮素（phloretin）是一种天然存在的二氢查耳酮，主要存在于苹果属物种（Malus spp.）中，近期作为具有生物除草剂（bioherbicide）开发潜力的植物毒性化感物质（phytotoxic allelochemical）而受到关注。然而，氧化应激（oxidative stress）对其植物毒性效应的贡献仍不清楚，且似乎具有物种依赖性。研究人员通过评估氧化应激标志物以及酶促和非酶促抗氧化响应，探究了氧化应激在根皮素诱导的荠菜（Capsella bursa-pastoris (L.) Medik.）植物毒性中的作用。经500 μM根皮素处理两周后，总酚含量（total phenolic content）和ABTS自由基清除能力（ABTS radical scavenging capacity）显著增加。总超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，同时Mn-SOD条带强度增强，表明线粒体抗氧化响应被强化。相反，过氧化氢酶（CAT）活性下降，而过氧化物酶（POX）活性保持不变。SOD活性升高而清除H₂O₂的酶活性未相应增加，并伴随丙二醛（MDA）和脯氨酸（proline）水平升高，提示抗氧化响应不足以恢复细胞氧化还原稳态（cellular redox homeostasis）并阻止氧化损伤。总体而言，研究人员的发现表明，根皮素处理导致氧化还原失衡，并伴随脂质过氧化（lipid peroxidation）增强，尽管抗氧化防御被激活，从而确定氧化应激是其植物毒性的一个重要且具物种依赖性的组成部分。

**研究背景与问题**

活性氧（ROS）是化学性质多样的含氧衍生物，在有氧代谢过程中持续产生，并在受控浓度下作为信号分子参与植物生长、发育和胁迫响应；但过量或失控的ROS产生会破坏细胞氧化还原稳态并引发氧化应激。植物通过由酶促和非酶促组分构成的抗氧化防御网络调控ROS水平，其中非酶促系统包括酚类化合物、谷胱甘肽、脯氨酸、类胡萝卜素以及抗坏血酸和生育酚等低分子量抗氧化剂，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POX）则是酶促抗氧化系统的主要组分。SOD催化超氧阴离子自由基（O₂^•?）歧化为过氧化氢（H₂O₂）和分子氧，CAT和POX随后清除H₂O₂；ROS生成与抗氧化能力之间的失衡可导致H₂O₂积累和氧化应激，并引起以丙二醛（MDA）升高为标志的脂质过氧化，同时脯氨酸等胁迫相关代谢物积累以参与渗透调节、膜与蛋白稳定及ROS清除。氧化应激被认为是化感物质植物毒性的主要间接机制之一。根皮素（3-(4-羟苯基)-1-(2,4,6-三羟苯基)丙-1-酮）是一种天然二氢查耳酮，主要存在于苹果属植物中，经根系分泌和植物残体分解进入根际后被认为参与苹果再植病（ARD）的发生；Yin等报道暴露于根皮素等物质的湖北海棠（Malus hupehensis (Pamp.) Rehder）幼苗根部防御与自由基清除相关蛋白丰度增加，提示氧化还原扰动可能参与其植物毒性。近期研究表明根皮素对拟南芥（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.）、荠菜和玉米（Zea mays L.）等多种非苹果属植物具有显著植物毒性，并表现出物种和组织依赖的多靶标作用模式：在拟南芥根中扰乱生长素稳态与空间分布，在地上部主要损害叶绿体超微结构和光合功能，导致淀粉耗竭、碳饥饿、自噬及程序性细胞死亡；在玉米根中破坏线粒体呼吸与细胞能量稳态，可能抑制FoF1-ATP合酶复合体，并伴随ROS积累、脂质过氧化增强和抗氧化防御激活；在玉米叶片中干扰C4碳代谢。然而，氧化应激是否为根皮素植物毒性的共同机制仍不清楚，因为既往研究报告了相反的抗氧化响应：拟南芥中根皮素引起的生长抑制未伴随明确的氧化应激证据，而玉米研究提示氧化应激可能是其植物毒性的重要组分，表明氧化应激并非根皮素暴露的普遍后果，而是其植物毒性作用中具物种依赖性的组分。为此，研究人员选择荠菜为实验模型，因为前期研究显示根皮素显著抑制其幼苗生长（尤其根伸长），并减少侧根数、叶片数和幼苗鲜重；同时荠菜作为十字花科成员，可用于评估拟南芥中缺乏氧化应激证据的现象是否延伸至该科其他成员，抑或属于物种特异性响应。本研究旨在通过评估氧化应激标志物及相关酶促与非酶促抗氧化响应，评价氧化应激在根皮素对荠菜植物毒性中的参与程度。

**主要技术方法**

以荠菜（Capsella bursa-pastoris (L.) Medik.）种子经表面消毒、低温层积和萌发后，在?强度Murashige and Skoog（?MS）营养培养基上离体培养；依据前期浓度与时间依赖性毒性研究，选用500 μM根皮素处理14天（对照含0.1% (v/v)二甲基亚砜（DMSO）），设3个独立生物学重复，每个重复含3个培养皿、每皿10株幼苗。采用Folin–Ciocalteu法测定总酚含量（TPC），以ABTS法和DPPH法测定抗氧化能力；分别以硫代巴比妥酸（TBA）法、茚三酮法和碘化钾法测定MDA、脯氨酸和H₂O₂含量；以Bradford法测定可溶性蛋白；采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）结合酶特异性染色及ImageJ软件条带定量分析CAT、SOD和POX同工酶，并以KCN和H₂O₂差异敏感性区分Mn-SOD、Fe-SOD和CuZn-SOD；SOD活性以黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶–细胞色素c（Cyt c）竞争法测定，CAT活性以240 nm下H₂O₂降解速率测定，POX活性以愈创木酚–H₂O₂体系生成四愈创木酚速率测定；数据以Student's t检验比较（p < 0.05）。

**研究结果**

总酚含量与抗氧化能力：处理14天后，根皮素处理幼苗总酚含量较对照增加83.2%，ABTS自由基清除能力增加263.2%，而DPPH自由基清除能力与对照无显著差异。作者指出，ABTS与DPPH测定结果的不一致反映了二者反应机制及对酚类化合物类别敏感性的差异，Platzer等证明二氢查耳酮与ABTS自由基反应高效而对DPPH自由基反应很弱或没有，提示ABTS更适合评价富含二氢查耳酮提取物的抗氧化能力；ABTS检测到的显著升高可能反映根皮素和/或其他具有类似氧化还原性质的酚类化合物积累。由于ABTS清除能力的增幅明显高于总酚含量的增幅，该抗氧化能力增强不能仅由总酚积累解释，而可能涉及酚类组成质的改变，即更强自由基清除能力酚类和/或其他非酶促抗氧化剂的积累。类似趋势曾在500 μM根皮素处理10天的拟南芥幼苗中观察到，其总酚含量和ABTS抗氧化能力分别增加175%和202%。

氧化应激标志物与脯氨酸：尽管总酚含量和ABTS抗氧化能力明显升高，根皮素处理仍使MDA含量显著增加29.9%、脯氨酸含量显著增加51.9%，而H₂O₂含量的升高无统计学显著性。MDA升高作为膜脂过氧化的公认标志，表明过量ROS生成造成了膜脂氧化损伤；脯氨酸积累则表明根皮素处理伴随胁迫适应机制，因脯氨酸不仅作为相容性渗透调节物质，还作为ROS清除剂、膜稳定剂和氧化还原调节剂参与维持胁迫下细胞稳态。作者认为该非酶促抗氧化响应似乎是补偿性而非完全保护性的，不足以阻止氧化损伤，因而进一步检测酶促抗氧化组分。

超氧化物歧化酶活性：根皮素处理使总SOD活性较对照显著增加41%，native PAGE鉴定出4个SOD同工酶，包括1个Mn-SOD、1个Fe-SOD和2个CuZn-SOD同工酶，其中Mn-SOD染色强度在处理后增强。Mn-SOD活性增强提示对超氧阴离子解毒的需求增加，尤其是在该同工酶主要定位的线粒体中；作者将其与Constantin等提出的根皮素通过抑制与氧化磷酸化相关的产ATP过程（可能抑制FoF1-ATP合酶复合体或腺嘌呤核苷酸转位酶）损害玉米根线粒体能量代谢的机制相联系，并指出根皮素直接相互作用抑制FoF1-ATP合酶复合体在哺乳动物线粒体中亦已得到证实。作者强调本研究未直接测定线粒体ROS产生，但总SOD活性升高与Mn-SOD染色增强可能反映对根皮素处理后线粒体超氧阴离子自由基产生增加的适应性响应。

过氧化氢酶与过氧化物酶活性：根皮素处理使CAT活性较未处理对照显著降低25%，凝胶内活性测定与分光光度结果一致，显示单一CAT同工酶条带强度降低；该降低与处理幼苗H₂O₂含量升高的趋势一致，可能表明依赖CAT的H₂O₂解毒能力下降。与CAT相反，根皮素处理未显著影响总POX活性，native PAGE显示POX活性总体模式和同工酶组成均无明显变化，对照与处理幼苗均检测到2个POX同工酶，且两者中POX2条带强度均高于POX1。POX未被诱导与CAT活性降低共同表明，酶促H₂O₂清除能力未因根皮素处理而增强；结合SOD活性升高和H₂O₂水平偏高的趋势，提示ROS生成与解毒之间存在失衡，该失衡可能促成以MDA显著升高为标志的氧化性膜损伤。作者据此在图7中总结了根皮素诱导荠菜氧化应激的推测机制。

**讨论与结论**

作者综合认为，在所采用的实验条件下，根皮素可能发挥促氧化作用，导致荠菜氧化还原稳态破坏，尽管酶促和非酶促抗氧化防御均被激活。酚类化合物虽普遍被认为具有抗氧化性，但其生物活性强烈受细胞环境影响，浓度、细胞氧化还原状态、氧可利用性、过渡金属离子和pH等均可决定其以抗氧化还是促氧化行为为主；在动物系统中，根皮素如许多天然黄酮类一样可能在较低浓度下表现细胞保护作用而在较高浓度下表现促氧化或细胞毒性作用，其细胞毒性浓度范围强烈取决于细胞类型和暴露时间，部分敏感的正常细胞类型在高于50–100 μM时即表现细胞毒性效应。在植物中，根皮素的生物学效应同样可能取决于植物物种和暴露浓度；在促氧化条件下，根皮素可被氧化为半醌和醌类中间体，促进氧化还原循环并可能增加ROS生成，从而促成植物细胞氧化应激。因此，500 μM根皮素处理在荠菜中引起的显著氧化响应与其剂量依赖性活性一致，支持其在该物种中的植物毒性效应至少部分与其促氧化潜力相关的假设。作者进一步指出，根皮素诱导氧化应激及相应抗氧化响应均表现出物种依赖性：拟南芥中未见明确氧化应激证据或抗氧化防御的显著激活，而本研究中荠菜幼苗出现膜脂过氧化增强并伴随酶促和非酶促抗氧化防御改变；水培玉米幼苗中根皮素同样触发抗氧化响应并升高氧化应激标志物，但两个物种的酶促抗氧化响应差异明显，荠菜中SOD活性升高、CAT活性降低、POX活性无显著变化，而玉米中CAT和POX活性升高、SOD活性下降，表明不同植物物种应对根皮素可能采用不同的抗氧化防御策略。这些差异至少部分可能反映C3与C4植物间更广泛的氧化还原调控差异，但既往比较研究结果并不一致，说明抗氧化表现不仅取决于基础酶活性，还取决于各ROS清除组分的协调与胁迫诱导调控；此外，C4光合相关的氧化还原组织在叶肉细胞与维管束鞘细胞间存在空间分隔，也可能参与其中。更重要的是，同为十字花科C3成员的荠菜与拟南芥响应相反，表明光合类型本身不能解释所观察到的差异，进一步凸显物种特异性氧化还原调控的重要性，其差异可能涉及基础抗氧化能力、抗氧化酶同工型的相对丰度与可诱导性，以及根皮素吸收、胞内分布和代谢转化的差异。作者指出本研究的局限在于生化分析仅在单一根皮素浓度和单一处理时间点进行，虽该条件基于前期剂量与时间依赖性毒性研究选定，但现有设计无法解析各氧化与抗氧化响应的剂量依赖性及时间顺序，因而所获结果提供的是长期根皮素暴露后氧化还原状态的整合视图而非其发展动力学；未来需纳入多浓度和更早处理时间点以区分初级响应与次级或累积效应，并进一步明确根皮素诱导氧化还原改变的动态。结论部分译为：总之，根皮素通过差异性调控酶促和非酶促防御机制显著改变了荠菜幼苗的抗氧化响应。根皮素处理提高了总酚含量、ABTS自由基清除能力、总SOD活性和Mn-SOD条带强度，而CAT活性下降、POX活性保持不变。由此产生的ROS产生与解毒之间的失衡伴随MDA和脯氨酸水平升高，提示所诱导的抗氧化防御不足以完全维持细胞氧化还原稳态。本研究结果支持氧化还原失衡对根皮素植物毒性的贡献具有物种依赖性这一观点。不同植物物种虽会募集不同的抗氧化防御策略，但靶标物种的生理特性似乎决定根皮素主要表现抗氧化还是促氧化行为，并进而决定氧化损伤的程度。这些发现凸显了在评价根皮素作为天然除草化合物的植物毒性潜力时考虑物种特异性氧化还原响应的重要性。