《AgriEngineering》：Optimization of the Development of a Lactic Acid Bacteria Inoculum in Pumpkin Juice for Potential Applications in the Fermentation of Plant-Based Matrices
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摘要专业翻译
本研究旨在评估蔗糖补充、奶粉补充、活化培养基中南瓜汁比例以及热处理对含有嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaric
摘要专业翻译
本研究旨在评估蔗糖补充、奶粉补充、活化培养基中南瓜汁比例以及热处理对含有嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）的商业混合发酵剂培养物总可培养乳酸菌（LAB）群体活力的影响，以开发适应植物基基质的接种物。实验过程包括筛选设计、最速上升路径和响应面优化，并辅以主成分分析（PCA）。细胞活力通过微生物计数（CFU/mL）测定，并以细胞活力对数增量（LVI）表示。精炼后的筛选模型具有统计学显著性（p = 0.003）。蔗糖补充（SS）和奶粉补充（PMS）对LVI表现出显著的正效应，而南瓜汁比例（PJ）表现出接近显著性阈值的负效应。优化预测最大LVI为5.01，对应SS为9.41%、PMS为5.84%，PJ固定为7.28%。模型决定系数（R2）为95.13%，实验验证显示预测响应与实验响应之间的相对误差为7.663%。主成分分析通过两个主成分解释了79.81%的变异性（PC1 = 61.02%，PC2 = 18.80%），其中PC1与电导率、盐度和悬浮固体相关，PC2与pH、总固形物和可滴定酸度相关。PCA描述了筛选处理中各理化参数的联合变异性。
论文解读文章
一、研究背景与问题
南瓜（Cucurbita moschata）属于葫芦科植物，起源于热带和亚热带地区。南瓜果肉具有广泛的营养特性，蛋白质含量为0.52%至13.42%，脂肪含量最高可达16.7%，碳水化合物含量为7.52%至40.32%，纤维含量为1.6%至13.35%，并含有镁、锌、钙、钠、钾和铁等矿物质。这一营养特性支持南瓜果肉作为有前景的植物基质，用于生产配料、发酵食品和具有功能潜力的产品的生物技术过程。
乳酸菌（LAB）已在多种植物基质中开展动力学建模、发酵过程、储存研究和益生菌饮料配方等研究。针对南瓜汁的研究考察了不同LAB菌株的微生物活力、理化变化、功能特性和益生潜力。这些研究证明了植物基质作为乳酸发酵底物的潜力，但也表明微生物响应取决于基质组成、所用菌株以及活化和培养条件。
将发酵剂培养物适应于植物基基质是一种值得关注的策略，可促进其在与原筛选基质特性不同的底物中的生长和代谢活性。然而，关于传统乳酸菌培养物在南瓜基质中适应和表现的可用信息仍然有限，特别是嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种作为商业混合培养物在此类底物适应过程中的响应。
在植物基质中开发LAB接种物具有技术相关性，因为它便于评估非常规底物中的细胞活力，并促进微生物对后续生长培养基的生理适应。这种适应可改善基质中营养物质的利用，提高发酵过程的稳定性，并改善过程可重复性。此外，使用植物基质作为微生物活化或增殖培养基可减少对传统微生物培养基的依赖，后者通常更昂贵，且不限制与食品应用相关的功能性代谢物合成。
植物基质是复杂、可变的系统，其组成可能不完全满足乳酸菌的营养需求，因为生长取决于底物可用性和培养条件。因此，补充快速发酵糖类（如蔗糖、麦芽糖或乳糖）以及提供氮源和其他营养物质的来源（如奶粉）可促进微生物的生长、活力和代谢活性。
蔗糖作为快速发酵补充剂，是细胞维持和微生物生长的主要能量来源。其与提供含氮化合物的补充剂联合使用可影响功能性代谢物的合成，如胞外多糖（EPS），因其对发酵体系的流变学、技术和功能特性具有潜在影响而受到关注。奶粉补充提供氨基酸、肽、含氮碱基、维生素和LAB代谢所需的其他生长因子。酵母提取物已被确定为最有效的氮源之一，但其成本可能限制过程的可扩展性和可重复性。因此，探索成本更低且广泛可用的替代方案以提供接种物开发所需营养仍属必要。
在此背景下，优化接种物活化条件对于确保在植物基基质（如南瓜）中开发可行的LAB群体至关重要。然而，培养基组分间的相互作用可能使微生物响应难以在单独评估因子时解释。因此，响应面方法等序贯统计方法有助于识别最有影响力的变量，指导改进条件的探索，并确定优化配方，同时减少所需实验次数。
二、研究内容与主要技术方法
本研究旨在通过序贯响应面方法，从商业混合发酵剂培养物在南瓜汁中开发和优化LAB接种物。实验设计包括三个阶段：（i）筛选设计，识别对接种物活力影响最大的配方和过程因子；（ii）基于所选一阶模型构建最速上升路径；（iii）应用响应面设计检验系统曲率、优化配方并实验验证预测条件。
研究人员采用的关键技术方法包括：筛选设计（部分因子设计，14次实验运行，考察南瓜汁比例、蔗糖补充、奶粉补充和热处理四个因子）；最速上升路径法（基于一阶模型系数比例确定步长和方向）；响应面设计（中心复合设计，17次实验运行，含因子点、轴向点和中心点）；期望函数优化（将响应转化为0至1的无量纲尺度并最大化）；主成分分析（PCA，对筛选阶段14个处理的pH、可滴定酸度、总固形物、悬浮固体、电导率和盐度进行多元统计分析）；微生物活力测定（微量滴板法，MRS琼脂，42°C培养，结果以CFU/mL表示并转化为LVI）。南瓜原料购自哥伦比亚卡利的一家超市，实验在哥伦比亚山谷大学（Universidad del Valle）生物过程实验室进行。
三、研究结果
3.1 筛选设计的实验结果
研究人员在筛选设计的14次实验运行中考察了接种物的生长响应，以LVI表示。结果表明，运行1、7和10产生了最高的LVI值，表明这些条件下的LAB生长更佳。蔗糖浓度为8%是这三个运行共有的唯一因子水平，表明该浓度在实验范围内有利于微生物生长。相比之下，奶粉浓度从4%到8%不等，表明在该补充范围内可维持高LVI。
3.2 筛选设计评估
初始模型具有统计学显著性（p = 0.011），解释了LVI变异的73.18%。然而，热处理（TT）的统计贡献可忽略（p = 0.814）。蔗糖补充（SS）和奶粉补充（PMS）对LVI具有显著正效应，而南瓜汁比例（PJ）具有接近显著性水平的负效应。帕累托图显示SS具有最大的标准化效应并显著超过临界参考值（t = 2.262），是最具影响力和统计学显著性的因子（p = 0.004）。PMS的标准化效应较小但也超过显著性阈值（p = 0.040）。去除TT后得到更简约的模型，改善了调整R2、预测R2和残差标准差。精炼后的编码模型为：LVI = 2.9817 + 0.465SS + 0.292PMS ? 0.253PJ。SS和PMS的正系数表明在实验范围内增加其水平促进了混合发酵剂培养物总可培养LAB群体的活力。
3.3 最速上升路径
基于编码模型，SS因具有最大正系数被选为参考因子。PMS需增加0.628编码单位，PJ需减少0.544编码单位。以SS实际浓度每步增加一个百分点为步长，从实验中心点开始逐步推进。实验评估显示LVI从步骤0到步骤2逐渐增加，在步骤2达到最高值2.57。响应在步骤3降至1.00，表明系统已越过一阶模型预测的改进区域。步骤2产生最佳实验响应，被选为响应面设计新实验区域的中心。
3.4 响应面设计
步骤2被选为新设计中心点，SS和PMS浓度分别为8.00%和7.26%，南瓜汁比例固定为7.28%。SS和PMS作为响应面设计的可变因子，SS范围为7.00%至9.00%，PMS范围为6.26%至8.26%。设计包含17次实验运行：四个因子点、四个轴向点、五个中心点以及因子点和轴向点的四个重复。拟合的编码模型为：LVI = 2.192 + 0.275SS ? 0.536PMS + 0.924SS×SS + 0.268PMS×PMS ? 0.819SS×PMS。方差分析表明模型具有统计学显著性（p < 0.001）。SS和PMS的线性项、两个因子的二次项和交互项均具有统计学显著性。模型R2为95.13%，调整R2为92.92%，预测R2为88.49%。等高线图显示PMS浓度约6.0%至7.5%和SS浓度约8.2%至9.5%有利于更高的LVI值。
3.5 响应面优化
数值优化确定最优因子水平为SS = 9.414%和PMS = 5.845%。模型预测最优条件下的LVI为5.016，总体期望值为1.00。高期望值表明所选因子组合接近实验区域内估计的最大值。
3.6 实验验证
验证过程使用六次实验重复，在相同最优操作条件下进行。LVI的实验均值为4.6317，预测值为5.0161。相对误差为7.663%，低于10%，表明实验响应与预测响应之间具有可接受的吻合度。标准误差为0.131，表明实验均值估计的变异性较低，测量精度充分。
3.7 主成分分析
PCA作为补充探索性分析，可视化了筛选阶段测量的理化参数间的联合变异性和关联。PC1与电导率、盐度和悬浮固体在正端关联更强，总固形物朝向负端。PC2与总固形物在正方向关联更强，与pH和可滴定酸度在负方向关联。电导率、盐度和悬浮固体的向量接近，pH和酸度的向量方向相似，表明这些变量在各处理间具有相似行为。LVI最高的运行（1、7和10）未形成独立分组，而是分布在整个平面上，表明微生物活力的增加并非由单一理化模式决定。
四、讨论与结论
统计分析成功识别并优化了旨在最大化南瓜汁接种物中乳酸菌LVI响应的发酵条件。筛选设计表明发酵培养基组成对评估响应具有显著影响，突出了蔗糖和奶粉补充的正效应，从而识别了影响最大的变量并选择了后续阶段最有利的范围。热处理在筛选期间未显著影响LVI响应，但其作为微生物控制步骤的潜在作用应与对接种物活力的影响分开评估。
基于最速上升路径，确定了朝向最大响应区域的实验方向，允许逐步调整研究因子水平，减少了达到接近最优点条件所需的试验次数。响应面方法描述了过程因子与微生物响应之间的关系，生成了能够在实验域内估计系统行为的预测模型。通过模型获得的最优条件随后经实验验证，显示出良好的一致性。研究结论指出，需要进一步研究以评估优化接种物在后续植物基质发酵过程中的性能。
