《Cell Reports Methods》：Single-cell proteomics of saliva enables noninvasive cell profiling in oral cancer
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基于质谱的单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics, SCP）有望在不依赖抗体标记的情况下解析复杂微环境中的细胞异质性，但其在临床可获取生物体液中的应用仍十分有限。本研究建立并验证了一种高覆盖度、无标记的SCP工作流程，能够在单个细胞水平
基于质谱的单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics, SCP）有望在不依赖抗体标记的情况下解析复杂微环境中的细胞异质性，但其在临床可获取生物体液中的应用仍十分有限。本研究建立并验证了一种高覆盖度、无标记的SCP工作流程，能够在单个细胞水平上对来自唾液和泪液等挑战性生物体液进行蛋白质组学分析，为未来的生物标志物发现和转化研究提供了方法论框架。利用新鲜和冻存的HeLa单细胞作为基准测试，该工作流可定量多达每细胞5,400个蛋白群（protein groups, PGs）。随后，研究人员将该工作流应用于健康供体（n = 398个细胞）的无创唾液和泪液样本，分别鉴定到每细胞最多1,000个和600个PGs。将该方法扩展至口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）患者（n = 526个细胞）的冻存唾液CD3+ T细胞后，研究人员定量了每细胞多达1,600个PGs，并识别出与免疫重塑相关的蛋白质组细胞状态。此外，探索性的轨迹分析提示了连续的蛋白质组状态转变，这与公开可用的单细胞转录组数据集一致。综上所述，这些结果为临床可获取且无创的生物体液的单细胞蛋白质组学分析建立了工作流程，并为在转化和临床研究中探究细胞异质性提供了框架。
一、研究背景与研究目的
非侵入性生物体液如唾液和泪液，因其易于采集、成本低廉且能减轻患者负担，是临床监测的理想样本来源。然而，由于单个细胞体积小、异质性高且蛋白质含量低，基于质谱（mass spectrometry, MS）的蛋白质组学在这些样本中的应用长期局限于整体（bulk）分析层面，无法揭示关键的细胞亚群差异。尽管已有研究通过整合唾液、泪液等体液的总体蛋白质组数据发现了头颈癌（head and neck cancer, HNC）转移特征，但仍缺乏足够的灵敏度和特异性来可靠地识别候选生物标志物和治疗靶点。因此，亟需一种能够从这些复杂体液中实现单细胞分辨率蛋白质组学分析的方法，以深入探究疾病进程中的细胞病理生物学机制。
二、研究方法概述
研究人员建立并优化了一套高覆盖度的无标记单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics, SCP）工作流程。关键技术包括：采用cellenONE X1自动化平台进行基于形态学和荧光参数的单个细胞分选与纳升级试剂分配；结合优化的低浓度去垢剂（0.05% DDM）样品制备方案以减少污染；使用Orbitrap Astral质谱仪搭配FAIMS Pro接口进行高通量数据非依赖性采集（data-independent acquisition, DIA）；并比较了Spectronaut和DIA-NN两种数据处理平台，最终选用DIA-NN进行后续分析。样本队列来源包括10名健康个体的混合唾液和泪液样本（各199个细胞），以及3名不同淋巴结转移状态的口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者（pT2N0、pT3N1、pT3N3）和1名匹配的健康对照的唾液CD3+ T细胞（共526个细胞）。
三、研究结果
1. 基准测试SCP工作流程：HeLa消化液和单细胞
研究人员首先利用HeLa标准蛋白消化液和单HeLa细胞对工作流程进行了基准测试。结果显示，在50 pg HeLa消化液中使用directDIA+搜索策略平均可鉴定5,463个蛋白群（protein groups, PGs），MS1水平的变异系数（coefficient of variation, CV）中位数为8.05%。对于单HeLa细胞，采用DIA-ME（matching enhancers）策略可实现高达每细胞5,491个PGs和37,378个肽段的深度覆盖，蛋白质数据完整度达82%，动态范围与250-500 pg的HeLa消化液相当。新鲜与冻存HeLa细胞的鉴定结果高度重叠，但主成分分析显示冻存过程引入了33%的变异。
2. 针对无创生物体液优化SCP工作流程：唾液和泪液
将工作流程应用于健康个体混合的唾液和泪液单细胞。形态测量分析揭示了显著的细胞大小异质性（唾液细胞直径5-45 μm，泪液细胞5-20 μm）。通过比较，DIA-NN软件在处理生物体液数据方面优于Spectronaut。经过空白对照（去除118个共享的背景蛋白群）和批次效应评估（未观察到明显批次效应）后，研究人员确认了方法的可靠性。
3. 生物体液中异质性单细胞群体的下游功能注释
通过均匀流形近似与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP）和Leiden聚类分析，唾液和泪液细胞分别被分为11个和12个簇，其中多个簇表现出独特的蛋白丰度谱。唾液细胞中鉴定出富含抗菌防御反应通路的免疫相关簇（如簇0）和腺体分泌功能的簇（如簇4，标记物PRB2）。泪液细胞则鉴定出经典泪液标记物（如LCN1、LCRT）高表达的簇。层级聚类显示，蛋白组学聚类并非由细胞大小驱动，而是反映了内在的蛋白质组异质性。与公共数据库比对发现，SCP数据重现了约三分之一的已知体液蛋白质组，并额外捕获了参与蛋白-RNA复合物（唾液中）和糖胺聚糖分解代谢（泪液中）等过程的蛋白质。
4. SCP工作流程在OSCC患者临床唾液样本中的应用
将工作流程应用于OSCC患者（pT2N0, pT3N1, pT3N3）和健康对照的冷冻保存、经流式分选的唾液CD3+ T细胞。这些细胞每细胞可鉴定多达1,600个PGs，且大部分PGs（1,268个）在所有条件下共有，证明了方法的稳健性。UMAP分析揭示了患者特异性的分组模式，共鉴定出11个细胞簇。经典免疫细胞标记物（如PTPRC, LCP1）广泛表达。不同的细胞簇富集了不同的功能程序：例如，簇9富集了核糖体蛋白和翻译机器，提示其为近期激活的T细胞效应样状态；簇0富集了氧化磷酸化等线粒体通路，类似于长寿命记忆T细胞；而簇8在淋巴结转移最晚期（pN3）患者中占主导，其特征是高表达胸腺素β4（TMSB4X），这是一种与肌动蛋白骨架重塑、细胞迁移和肿瘤进展相关的蛋白。
5. SCP分型唾液识别OSCC中不同的细胞状态
通过差异丰度蛋白（differentially abundant proteins, DAPs）分析和探索性轨迹推断（pseudotime），研究人员发现随着疾病进展（从健康对照到pN0再到pN+），细胞蛋白质组发生渐进性重塑。鉴定出的DAPs（如TMSB4X, MMP9, KRT19等）富集于免疫应答和吞噬作用等生物学过程。轨迹分析表明，pN+患者的细胞位于推断轨迹的后期阶段。通过与两个独立的头颈癌单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（Choi et al. 和 Puram et al.）进行比较，研究人员发现18个共同的轨迹相关标记物，这些标记物主要富集于细胞骨架组织和机械调控通路。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析进一步揭示了这些蛋白在早期、过渡期和晚期三个阶段呈现动态重塑模式。
四、讨论与结论
本研究成功建立并验证了一套适用于无创生物体液（唾液和泪液）的高覆盖度SCP工作流程，首次实现了对OSCC患者唾液CD3+ T细胞在单细胞蛋白质组层面的表征。研究证实，该工作流能够解析健康个体体液中的免疫和分泌性细胞群体，并能识别与疾病状态相关的候选蛋白组学状态。特别地，在淋巴结转移患者中发现的TMSB4X高表达现象，揭示了与细胞骨架可塑性相关的T细胞蛋白组学程序，这可能与增强的迁移能力和对转移性微环境的适应有关。通过与公开scRNA-seq数据的整合分析，研究人员发现了一些在转录组和蛋白质组水平上均保守的分子特征，同时也强调了直接测量蛋白质层级的独特价值。尽管当前无标记工作流程的通量和灵敏度仍有限制（如无法可靠区分CD4+和CD8+ T细胞亚群），但本研究的结论是：唾液SCP作为一种无创液体活检手段，能够有效表征免疫细胞异质性并揭示与口腔癌疾病进程相关的候选蛋白组学状态，为未来在更大规模临床队列中进行生物标志物验证和转化研究奠定了方法论基础。
