## 新型Totarol衍生酮类化合物的设计与半合成：体外抗寄生虫评价及分子对接研究

《Current Issues in Molecular Biology》：Design and Hemisynthesis of Novel Totarol-Derived Ketone Derivatives: In Vitro Antiparasitic Evaluation and Molecular Docking Studies

　　

利什曼病与弓形虫病属于被忽视的寄生虫病，由于治疗选择有限、药物毒性以及耐药性不断出现，其仍是全球重大公共卫生问题。在此背景下，基于天然产物骨架开发新型抗寄生虫药物具有重要意义。Totarol（一种自Tetraclinis articulata中分离得到的天然松香烷型二萜）被用作半合成修饰的起始骨架。研究人员合成了一系列Totarol衍生的官能化酮类化合物，包括α-溴代酮（4）与查尔酮衍生物（5a–g），并通过核磁共振（NMR）、红外光谱（IR）和高分辨质谱（HRMS）对其进行了全面表征。研究人员评价了这些化合物对Leishmania major（L. major）和Toxoplasma gondii（T. gondii）的体外抗寄生虫活性。化合物4活性最高，对L. major的半数抑制浓度（IC₅₀）为3.2–5.3 μM，对T. gondii为6.1 μM。然而，化合物4对宿主细胞无强选择性，选择性指数（SI）为0.79–1.5。针对L. major蝶啶还原酶1（PTR1）的对接给出Glide XP评分为?5.3 kcal/mol，且所建复合物在100 ns分子动力学模拟中保持稳定。上述计算结果仅提出关于抗利什曼原虫活性的假设，并未证明PTR1受到抑制，亦不能解释其对T. gondii的活性。这些活性结构在作为抗寄生虫候选物被考虑之前，仍需大幅优化其选择性。

## 论文解读

利什曼病与弓形虫病属于被忽视的寄生虫病，受限于治疗药物种类有限、毒性明显及耐药性出现，其治疗仍面临严峻挑战。其中，Leishmania major（L. major）为锥虫科寄生虫，是人兽共患皮肤利什曼病的重要病原体，可形成持续性皮肤损伤与瘢痕；其胞内无鞭毛体（amastigote）在巨噬细胞内增殖，是哺乳动物宿主体内与疾病相关的阶段，而前鞭毛体（promastigote）则提供了便利的胞外筛选模型。Toxoplasma gondii（T. gondii）为专性胞内顶复门寄生虫，可导致先天性疾病、眼部病变及免疫缺陷患者的严重机会性感染，现有治疗主要作用于速殖子（tachyzoite），不能清除组织包囊，且药物毒性可能限制治疗。鉴于天然产物骨架经进化预优化而具备与生物靶标结合的优势，二萜类（diterpene）因其C20碳骨架及抗炎、抗菌、抗寄生虫、抗癌等多重活性成为药物化学中的优势骨架。松香烷类中的Totarol 1（I）具有独特三环酚结构及广谱生物活性，自Tetraclinis articulata等针叶植物分离所得，与ferruginol（II）对Leishmania donovani前鞭毛体均显示IC₅₀为3.5 μg/mL的活性；半合成Totarol衍生物（III）对L. major无鞭毛体亦有活性，硝基取代类似物IC₅₀为13.1–18.2 μg/mL。另一方面，具有α,β-不饱和羰基结构的甾体杂合体（IV、V、VI）及查尔酮衍生物显示出抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗寄生虫、抗利什曼原虫等活性，其生物活性主要归因于亲电性烯酮部分，共轭π体系亦赋予良好理化性质，且Claisen–Schmidt缩合使其易于合成。基于分子杂合策略，研究人员将Totarol的二萜骨架与查尔酮药效团结合，设计并合成了新型Totarol–查尔酮杂合衍生物，并制备相应α-溴代酮；此前研究中，Totarol衍生α-溴代酮已被转化为噻唑衍生物，其中化合物（VII）通过诱导caspase依赖性凋亡显示最强抗癌活性。本研究旨在建立新的乙酰化Totarol衍生物的互补合成路线，评价其对L. major与T. gondii的体外抗寄生虫活性，考察官能化酮引入对Totarol骨架生物活性的影响，并筛选可供进一步评价与优化的结构。生物筛选与后续靶向计算分析的依据不同：在锥虫科中，蝶啶还原酶1（PTR1）为NADPH依赖性酶，可还原补救性蝶啶与叶酸，其叶酸还原活性可绕过二氢叶酸还原酶–胸苷酸合成酶抑制而参与抗叶酸耐药，故对化合物4开展针对L. major PTR1的探索性对接；PTR1并未作为T. gondii的靶标研究，其对接结果亦不用于解释抗弓形虫活性。

在技术方法上，研究人员自Tetraclinis articulata木材粉末分离Totarol（1），经甲基化、Friedel–Crafts乙酰化及NBS α-溴代得到化合物4，并经Ba(OH)₂介导的Claisen–Schmidt缩合制备查尔酮5a–g，以NMR、IR、HRMS表征；采用L. major前鞭毛体（分离自沙特患者，2016年2月，经BALB/c小鼠传代维持毒力；动物实验经Qassim University研究伦理委员会批准，编号20-03-20）、鼠腹腔巨噬细胞内无鞭毛体及T. gondii RH株速殖子（Vero细胞培养）进行体外药效评价，MTT法及Giemsa/toluidine blue染色测定IC₅₀与CC₅₀并计算SI；进而以Glide XP对接L. major PTR1（PDB ID: 5L4N）并用Desmond进行100 ns分子动力学模拟（OPLS4力场）。

结果部分：3.1 Chemistry——以Totarol为起始物，经酚羟基甲基化、AlCl₃催化乙酰化、NBS/硅胶α-溴代及Ba(OH)₂/乙醇Claisen–Schmidt缩合，以52–97%的产率获得目标查尔酮5a–g及α-溴代酮4。3.2 Characterization——¹H、¹³C NMR与HRMS证实化合物4中乙酰基α-质子消失并出现4.56 ppm亚甲基单峰、¹³C在35.3 ppm出现亚甲基碳；5a–g的烯属质子位于7.20–7.98 ppm、相应碳位于111.1–144.9 ppm，IR显示共轭C=O（1599–1663 cm^?1）与芳香C=C（1529–1605 cm^?1）吸收；以5e为例，H-22与H-23为7.62与7.20 ppm双峰（J = 15.6 Hz），证实双键反式构型，HRMS确认分子式C₃₂H₄₃NO₂Na。3.3 In Vitro Antiparasitic Activity and Structure–Activity Relationship——化合物4对L. major前鞭毛体与胞内无鞭毛体IC₅₀分别为3.2与5.3 μM，但巨噬细胞CC₅₀为4.9 μM，SI仅1.5与0.92，远低于SI > 10的筛选基准，无鞭毛体SI < 1提示宿主细胞毒性可能参与表观抗寄生虫效应；对T. gondii IC₅₀为6.1 μM，Vero细胞CC₅₀为4.8 μM，SI为0.79；化合物5f对T. gondii IC₅₀为18.7 μM、CC₅₀为39.4 μM（SI = 2.11），仅属系列内相对改善。初步构效关系（SAR）提示酮的α-官能化可调节活性，α-溴代酮4活性高于查尔酮类似物，但其亲电α-溴代羰基可能非特异性作用于细胞亲核体而增加毒性（此可能性未经验证）；5f的2-呋喃基空间位阻较小且提供氢键受体，5b的邻甲氧基可能通过位阻改变芳基–烯酮构象，5g体积与疏水表面较大可能限制水相可利用度或有效细胞暴露；5b与5g在最高浓度下未达50%抑制（分别>140与>57 μM），其SI无法计算。多数衍生物对胞内无鞭毛体无活性，可能与阶段依赖性暴露或易感性有关。3.4 Molecular Docking——化合物4的Glide XP评分为?5.3 kcal/mol，与His241形成π–π堆积，与Met183、Tyr283、Leu226、Phe113、Leu229、Tyr194、Tyr191、Leu188形成疏水作用，与Ser227形成极性作用，与Asp181形成带电作用；对照配体6QT再对接重现晶体结合模式（重原子RMSD 1.82 ?），评分为?6.70 kcal/mol，二者共享Phe113、Asp181、Leu188、Tyr194、Leu226、Ser227、Leu229、His241与Tyr283九个接触残基；上述残基与已报道的PTR1抑制剂一致。3.5 Molecular Dynamics (MD) Simulation——100 ns模拟中PTR1 Cα RMSD稳定于约2 ?，配体RMSD在有限范围内波动；与配体持续接触的残基为Met183、Leu188、Leu189、Tyr191、Leu226、Tyr283、Arg287与Ala288；化合物4与Leu189的氢键维持65%模拟时间，并与Leu188、Tyr283、Tyr191保持疏水接触；但单条轨迹不能确立全局收敛、实验结合亲和力、酶抑制或生物机制。

讨论与结论部分指出，本研究成功合成并表征了Totarol衍生官能化酮（5a–g及4），证实Totarol骨架结构修饰显著影响生物活性；化合物4体外抗寄生虫活性最强，但对L. major前鞭毛体与胞内无鞭毛体SI分别为1.5与0.92、对T. gondii为0.79，选择性差，其胞内活性可能受宿主细胞毒性影响；5f对T. gondii的SI为2.11，仍低于SI > 10基准，故现有结果不支持二者作为选择性抗寄生虫候选物。对接与分子动力学仅提示化合物4可被容纳于L. major PTR1结合位点，未进行直接生化抑制或靶标结合实验，PTR1抑制尚未证实，且不能解释其抗T. gondii活性。α-溴代酮与2-呋喃基查尔酮基序可作为后续类似物设计的起始结构，提高宿主细胞选择性为近期优先目标；未来需在非细胞毒性浓度下确证直接抗寄生虫效应、检验所提分子靶标并表征渗透性、稳定性与胞内暴露，后续体内药代动力学、疗效与耐受性研究或可阐明其生物学潜力，但依现有结果不能推定生物利用度改善或毒性降低。

**结论翻译**：本研究成功合成了一系列Totarol衍生官能化酮，包括新型查尔酮类似物（5a–g）及相应α-溴代酮衍生物（4），并采用光谱技术完成结构表征。对其抗L. major与T. gondii潜力的评价显示，Totarol骨架的结构修饰显著影响生物活性。化合物4在受试衍生物中体外抗寄生虫活性最高，但其对L. major前鞭毛体与胞内无鞭毛体的SI分别为1.5与0.92，对T. gondii为0.79，表明选择性差；其对胞内寄生虫的活性可能受宿主细胞毒性影响。化合物5f对T. gondii的SI较高，为2.11，但仍低于本研究所用SI > 10基准。因此，现有结果不支持二者以当前形式作为选择性抗寄生虫候选物。对接与分子动力学提出了化合物4可被容纳于L. major PTR1结合位点的假设；由于未进行直接生化抑制或靶标结合实验，PTR1抑制仍未获证实，且这些计算不能解释所观察到的抗T. gondii活性。α-溴代酮与2-呋喃基查尔酮基序为进一步类似物设计提供了起始结构，近期优先事项为提高宿主细胞选择性；未来工作应在非细胞毒性浓度下确证直接抗寄生虫效应、检验所提分子靶标，并表征渗透性、稳定性与胞内暴露；随后开展的体内药代动力学、疗效与耐受性研究或可阐明其生物学潜力，但依当前发现不能推定生物利用度改善或毒性降低。