# 两个甘薯野生近缘种中阳离子氨基酸转运蛋白（CAT）基因的生物信息学鉴定

《Current Issues in Molecular Biology》：Identification Using Bioinformatics Tools of Cationic Amino Acid Transporter (CAT) Genes in Two Wild Ancestors of Sweetpotato

　　

甘薯[Ipomoea batatas (L.) Lam.]是世界上最重要的粮食作物之一，其野生近缘种是改良抗逆性和作物表现的宝贵遗传资源。在氨基酸转运蛋白（AATs）中，阳离子氨基酸转运蛋白（CATs）在氨基酸（aa）吸收、氮（N）分配、植物发育及环境胁迫响应中发挥基础性作用。然而，CAT基因家族尚未在Ipomoea物种中得到系统表征。本研究对二倍体甘薯近缘种I. trifida和I. triloba的CAT基因进行了全面的全基因组鉴定与表征。共鉴定出21个CAT基因，其中I. trifida 13个、I. triloba基因组8个。比较分析显示基因结构和蛋白理化性质存在显著变异，而保守基序、系统发育关系与共线性则支持物种间高度的进化保守性。重复分析仅检测到分段重复对（I. trifida 3对、I. triloba 2对），均在纯化选择下进化。转录组分析进一步揭示了明显的组织特异性表达模式以及对干旱、盐、冷、热胁迫的差异转录响应，提示CAT家族成员间存在功能分化。总体而言，这些发现首次对野生Ipomoea物种的CAT基因家族进行了全面表征，为其进化历史提供了新见解，并为旨在提高非生物胁迫耐受性的未来功能研究和甘薯育种计划鉴定了候选基因。

**研究背景与问题** 甘薯[Ipomoea batatas (L.) Lam.]（2n = 6x = 90）因高产、营养丰富、环境适应性强及社会经济价值而在发展中国家的重要蔬菜作物中占据突出地位，属于旋花科（Convolvulaceae）中最大的属之一Ipomoea。其六倍体基因组的复杂性使进化历史仍有争议，现有证据提示栽培甘薯可能通过涉及二倍体近缘种I. trifida（2n = 2x = 30）和I. triloba（2n = 2x = 30）的杂交事件产生。氨基酸（aa）作为植物代谢与结构化合物以及核苷酸、叶绿素、植物激素和次生代谢物（SMs）的前体，具有多种必需功能；植物通过不同家族的转运蛋白吸收aa。氨基酸转运蛋白（AATs）为介导aa跨细胞膜运输的整合膜蛋白，分为氨基酸转运蛋白家族（ATF）和氨基酸–多胺–胆碱（APC）家族；APC家族包括阳离子氨基酸转运蛋白（CATs）、L型氨基酸转运蛋白（LATs）及GABA通透酶（GAPs）。CAT转运蛋白参与多胺生物合成、一氧化氮（NO）合成、蛋白质合成和aa流，通常定位于细胞膜或液泡，含约11~14个推定跨膜（TM）结构域，属高亲和性碱性aa转运蛋白（HATs）。随着测序技术发展，CAT基因已在Camellia sinensis、Solanum lycopersicum、Gossypium spp.、Cicer arietinum L.、Phaseolus vulgaris、Zea mays和Brassica napus等作物中鉴定，但Ipomoea spp.尚无报道。因此，研究人员旨在对两个甘薯物种基因组中的CAT基因进行全基因组鉴定，并通过多种生物信息学分析加以表征，同时利用RNA-seq数据分析其在正常条件和水分胁迫下各组织的转录谱，为聚焦气候适应性的遗传改良提供基因资源和适应机制。

**关键技术方法** 研究未涉及实验室实验，所用二倍体野生近缘种为I. trifida（NSP306）和I. triloba（NSP323），基因组组装、结构注释和预测蛋白质组来自Ipomoea基因组数据库。主要方法包括：以关键词搜索和以拟南芥九个CAT蛋白为查询的BLASTp搜索（E值阈值1 × 10^?5，最小一致性和查询覆盖度均为80%）鉴定候选基因，并用NCBI CD-Search和InterProScan筛选含AA_permease（PF00324）和/或AA_permease_2（PF13520）保守结构域的蛋白；用ExPASy-ProtParam和Plant-mPLoc预测理化性质与亚细胞定位；用GSDS 2.0和MEME v5.5.9分析基因结构与保守基序；用MG2C v2.1作图、MCScanX（经TBtools v2.561）鉴定重复模式并用KaKs_Calculator 2.0（YN法）计算Ka/Ks；用Phyre2.2进行同源建模预测三维（3D）结构；用MEGA7以最大似然（ML）法（JTT + G + I模型，1000次bootstrap）构建系统发育树；用MCScanX进行共线性分析；利用Ipomoea基因组数据库公开RNA-seq数据集（FPKM值经log2(FPKM)转换和Z-score标准化，SRplot绘制热图）进行电子表达分析。

**研究结果**
3.1 鉴定与序列分析：共鉴定21个CAT基因（I. trifida 13个、I. triloba 8个），按染色体位置升序以"Itf"和"Itb"前缀命名。CDS长度219 bp（ItfCAT3）至3174 bp（ItfCAT13），编码72 aa至1057 aa的蛋白，分子量8.06 kDa至114.57 kDa，pI 6.02（ItfCAT13）至9.88（ItfCAT11）；以pI 7.0为参照，8个蛋白为酸性、ItfCAT2基本中性、其余12个为碱性。所有蛋白GRAVY值为正，表明具疏水性，ItfCAT11最低（0.033）、ItfCAT1最高（0.833）。亚细胞定位预测显示CAT主要定位于细胞膜，ItfCAT11和ItbCAT8预测定位于叶绿体，ItfCAT1和ItfCAT10获得包括叶绿体（ItfCAT1还包括线粒体）的多重预测。
3.2 基因结构与保守基序：内含子数目在I. trifida为0~14、I. triloba为0~13；ItfCAT9和ItbCAT5无内含子，仅含单个外显子。MEME分析15个保守基序显示，ItfCAT4、ItfCAT5、ItfCAT7和ItfCAT13结构更保守，而ItfCAT1、ItfCAT2、ItfCAT3和ItfCAT6结构较简单，提示I. trifida中该家族在基因重复后发生分化；ItbCAT2、ItbCAT3和ItbCAT5基序模式高度相似，提示强进化保守性，ItbCAT6、ItbCAT7和ItbCAT8共享扩展的基序集（含基序9、11、13、14），提示结构复杂性更高且可能源于基因重复；最小的ItbCAT4（425 aa）仅含8个基序，缺乏基序7、8和15。
3.3 染色体分布、重复模式与进化分析：I. trifida的13个CAT基因不均匀分布于15条染色体中的7条，4号染色体最多（3个），5号和11号各1个，8、9、12和15号各2个。I. triloba的8个基因分布于7条染色体，15号染色体含2个，4、5、8、9、11和12号各1个。两种物种均仅检测到分段重复对：I. trifida 3对（ItfCAT2/ItfCAT8、ItfCAT7/ItfCAT12、ItfCAT10/ItfCAT12），I. triloba 2对（ItbCAT1/ItbCAT4、ItbCAT6/ItbCAT7），未检测到串联重复。所有重复对的Ka/Ks为0.33~0.60，均低于1.0，表明重复后受纯化选择；估计重复时间为9.33~14.33 Mya，最早为ItfCAT7/ItfCAT12（14.33 Mya），其次为ItfCAT10/ItfCAT12（14.00 Mya），ItfCAT2/ItfCAT8和ItbCAT1/ItbCAT4约10.00 Mya，ItbCAT6/ItbCAT7最近（9.33 Mya）。
3.4 三维结构：用Phyre2.2基于各aa序列同源建模预测全部CAT蛋白的3D模型，置信度为67%~84%，模型共有多个α-螺旋和β-折叠等特征，预测的结构差异似乎反映蛋白大小的差异。
3.5 系统发育关系：将两个野生甘薯近缘种与拟南芥、O. sativa L.和Z. mays的CAT序列比对并以ML法建树（以OsLHT为外群），结果显示CAT蛋白分布于所代表物种中并形成独立类群，LHT外群确认所鉴定蛋白属于CAT；由于CAT蛋白无标准命名，基因采用物种特异性前缀At、Os、Zm、Itf和Itb命名。
3.6 共线性分析：全基因组共线性分析显示拟南芥与两个Ipomoea物种间存在若干保守染色体区块；在保守区内，I. trifida与拟南芥间鉴定5对共线性CAT基因对（ItfCAT4、ItfCAT5、ItfCAT7、ItfCAT9、ItfCAT12分别对应AtCAT6、AtCAT5、AtCAT4、AtCAT8、AtCAT4），I. triloba与拟南芥间3对（ItbCAT2、ItbCAT5、ItbCAT7分别对应AtCAT6、AtCAT8、AtCAT4），I. trifida与I. triloba间9对，三个物种共检测到17对共线性CAT基因对。AtCAT4位点与I. trifida两个基因（ItfCAT7和ItfCAT12）呈共线性关系，而I. triloba中仅鉴定到单个直系同源基因ItbCAT7，且ItfCAT7和ItfCAT12构成一个分段重复对，提示含AtCAT4的基因组区域在I. trifida与共同祖先分化后经历了谱系特异性重复事件。
3.7 组织特异性表达谱：I. trifida的13个CAT基因在根、叶、茎、花和花芽间转录丰度差异显著，ItfCAT7和ItfCAT8在花芽中积累最高，ItfCAT2、ItfCAT11和ItfCAT13在茎和/或花中高表达，ItfCAT5在花芽中表达较低，ItfCAT3、ItfCAT4和ItfCAT11在叶中表达升高，根部多数CAT基因转录丰度较低但ItfCAT12在两个根样本中表达较高。I. triloba的8个基因亦呈组织依赖模式，ItbCAT8在花中最高，ItbCAT3主要于茎中表达，ItbCAT7呈根特异性表达（尤其根2），ItbCAT2和ItbCAT5偏好积累于叶，花芽中多数基因表达较低但ItbCAT2维持较高丰度；层次聚类将转录谱相似的基因分组，揭示两个物种中不同的表达模块，提示家族成员在营养生长和生殖发育中功能分化。
3.8 非生物胁迫下的表达谱：I. trifida中多数基因在干旱下表达相对稳定，盐胁迫下变化更明显，ItfCAT10在盐胁迫下转录丰度降幅最大，ItfCAT4、ItfCAT5、ItfCAT6和ItfCAT11亦较对照降低，而ItfCAT1、ItfCAT2、ItfCAT3、ItfCAT7、ItfCAT8、ItfCAT9、ItfCAT12和ItfCAT13在两种条件下维持较高转录水平；冷胁迫下多数基因表达谱与对照相似，ItfCAT2在冷处理下降低，ItfCAT8、ItfCAT10、ItfCAT12和ItfCAT13仍为高表达基因；热胁迫引起的整体转录谱变化较小，ItfCAT12仍为表达最高成员，ItfCAT5、ItfCAT6和ItfCAT11在对照和热胁迫下均持续低表达。I. triloba中，干旱和盐胁迫下ItbCAT3、ItbCAT4、ItbCAT5和ItbCAT8维持较高丰度，而ItbCAT1、ItbCAT6及尤其ItbCAT7表达明显降低；冷胁迫引起有限变异但ItbCAT1进一步受抑制；热胁迫下整体表达模式基本保守，ItbCAT2、ItbCAT3、ItbCAT4、ItbCAT5和ItbCAT8相对稳定，ItbCAT6和ItbCAT7持续弱表达。这些结果表明CAT家族成员具有多样的胁迫响应表达谱，部分基因在多种胁迫下维持组成型高表达，另一些则呈条件依赖调控。

**讨论与结论** 讨论指出，CAT作为APC家族成员介导阳离子氨基酸运输并参与氮代谢，通过调控aa稳态影响氮利用效率（NUE）、植物生长、生殖发育和逆境响应。CAT基因数目在物种间变异较大，如拟南芥9个、O. sativa L. 11个、Glycine max 19个、G. hirsutum L. 28个，而本研究在I. trifida和I. triloba分别鉴定13个和8个，与Z. mays（14个）和拟南芥（9个）相当，但远低于多倍体棉花（四个测序基因组共79个）和B. napus（22个）；这种变异主要归因于谱系特异性全基因组重复（WGD）、差异基因保留和基因丢失，而非CAT蛋白功能重要性的差异。所鉴定的CATs虽aa数目变异大（72~1057），但均含保守氨基酸通透酶结构域，支持其归类；分子量和pI的变异可能提示蛋白稳定性、定位和互作模式的潜在差异。染色体分布不规则且呈簇状，提示基因扩展有限。仅检测到分段重复，与棉花中分段重复为主要扩展来源一致；分段重复基因通常因编码必需生物学过程蛋白而被保留，而串联重复常与环境适应相关的快速进化基因簇有关，但仅5对重复限制了关于各重复模式相对贡献的推断。Ka/Ks均低于1.0表明强纯化选择，估计重复时间（9.33~14.33 Mya）提示CAT基因扩展发生于Ipomoea属多样化早期，重复基因的长期保留表明其功能重要性。尽管重复对在纯化选择下进化，对内的旁系同源基因在组织和胁迫条件下表达谱不同（如ItfCAT10在盐胁迫下强烈抑制而其旁系同源ItfCAT12维持高丰度），这种分化符合重复后调控分化的可能，最终可能导致亚功能化或新功能化，但尚需启动子分析、表达验证和各拷贝的功能表征加以区分。3D结构分析提示这些蛋白结构保守、分子机制可能通过其生物学功能得以保留。系统发育分析提供了物种间遗传与进化关系信息并有助于鉴定直系同源和旁系同源基因；尽管CAT蛋白共享保守基序结构，其转录谱在组织和非生物胁迫间差异明显，表明调控分化伴随该基因家族的进化保守性；I. trifida与I. triloba间高水平染色体共线性反映二者密切的进化关系。若干CAT基因优先在生殖组织（尤其花芽和花）表达，另一些主要在叶、茎或根中积累；aa是高等植物有机氮的主要运输形式，其分配与各器官代谢需求紧密协调，生殖组织中的差异表达可能反映花器官分化、花粉成熟、受精及随后种子发育对aa运输的强烈需求，而叶和根中的优先表达提示其在氮获取、韧皮部装载、源–库运输和aa再动员中的作用。CAT基因对干旱、盐、冷和热胁迫呈不同转录响应，尤其在盐胁迫下，aa转运蛋白不仅参与氮分配，还参与渗透调节、aa稳态、多胺生物合成、NO代谢、氧化还原平衡和胁迫信号传导；棉花GhCAT10D正调控耐盐性，支持CAT介导的aa运输是双子叶植物非生物胁迫适应的保守机制。基于重复、共线性与表达分析的证据，研究人员提出候选基因：ItfCAT10和ItbCAT1在盐胁迫下转录丰度降幅最明显，为盐响应研究候选，应考察其与GhCAT10D的系统发育关系；ItfCAT12在所有胁迫条件下高表达、参与两个分段重复对且位于与AtCAT4共线性区域，提示保守的组成型aa运输作用，其与ItfCAT10的对比盐响应使该对成为检验重复后调控分化的合适模型；ItfCAT7、ItfCAT8和ItbCAT8在花芽或花中优先表达，为向生殖器官供应aa的候选。对二倍体物种CAT基因家族的认识可为今后六倍体栽培甘薯研究奠定基础，支持提高块根产量与品质及发展可持续、区域特异性生产策略。结论部分译为：总之，研究人员通过全基因组分析在两个二倍体Ipomoea物种（I. trifida和I. triloba）中鉴定出21个CAT基因，利用多种生物信息学工具概述了其结构特征，包括基因外显子–内含子结构、保守基序、系统发育、3D结构及其他分析；本研究所述的有价值信息为研究CAT基因的分子机制奠定了基础，并支持该物种育种计划中所用策略的开发。