基于qPCR的蜜蜂微孢子虫感染水平评估工作流程开发与初步评价

《Insects》：Development and Preliminary Evaluation of a qPCR Workflow for Assessing Nosema ceranae Infection Levels in Honey Bees (Apis mellifera)

由微孢子虫东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）引起的微孢子虫病（Nosemosis）是蜜蜂（Apis mellifera）的一种主要消耗性疾病，而准确评估感染水平是诊断和制定控制策略的前提。本研究旨在开发并初步评估一套用于评估蜜蜂体内N. ceranae感染水平的qPCR工作流程，特别关注样品前处理和校准方法。研究人员基于对样品前处理条件的初步比较，选定了一种结合额外匀浆步骤和自动化核酸提取系统的候选DNA提取工作流程。在针对Hsp70基因的定量PCR（qPCR）中，在所测试的稀释条件下，提取DNA的10倍稀释液展现出最有利的校准特性，并被选用于后续分析。当使用两种校准方法对感染样品进行定量时，孢子校准的qPCR估计值比显微镜孢子计数平均高出0.803 log10单位。质粒校准的DNA拷贝数输出在数值上比显微镜孢子计数低大约两个数量级，尽管DNA拷贝数与孢子数代表不同的量。这些结果表明，在所测试的条件下，校准方法会影响数值输出，但这并未确立定量的准确性，也未分离出基质不匹配的贡献。

一、研究背景与问题

蜜蜂作为全球约三分之一农作物的重要传粉媒介，其蜂群健康状况的下降直接影响农业生产和粮食安全。近年来，由微孢子虫属寄生虫引起的微孢子虫病（Nosemosis）被反复证实是导致蜜蜂个体和蜂群慢性生产力损失的主要病原体之一。其中，东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）自本世纪中期以来已在西方蜜蜂中广泛传播，并很大程度上取代了原先占主导地位的N. apis。受感染的蜜蜂因中肠上皮受损而导致营养吸收障碍、寿命缩短和觅食活动减少。

目前，诊断蜜蜂微孢子虫感染的方法包括显微镜直接观察孢子、免疫学检测和基于聚合酶链式反应（PCR）的分子诊断方法。显微镜检查因其便捷、低成本而被广泛用作一线筛查手段，但其无法区分形态相似的N. apis和N. ceranae孢子，且对于早期或低强度感染可能因低于检测限而漏检。使用血球计数板直接计数孢子是定量评估感染强度的标准方法，但该方法存在操作者间差异、取样偏差以及在低感染强度下灵敏度受限等问题，其检测限约为每只蜜蜂2.40 × 10⁴个孢子。

为克服上述局限，针对微孢子虫特异性基因的定量实时PCR（qPCR）已成为间接评估感染水平的主流替代方法。然而，qPCR本身也存在局限性。其标准曲线通常由纯化的质粒DNA或PCR扩增子系列稀释构建，完全缺乏真实样品的复杂生物基质，因此无法反映基质依赖性的扩增效率变化，可能导致系统性偏差。此外，靶标选择也会影响qPCR结果的解读，即使使用单拷贝基因，靶标DNA拷贝数也不能假定与成熟孢子数直接对应。

因此，本研究旨在开发和初步评估一套用于评估蜜蜂N. ceranae感染水平的qPCR工作流程。为此，研究人员比较了选定的前处理条件，并将自动化核酸提取系统整合到工作流程中。同时，将基于质粒和基于孢子的校准方法与显微镜孢子计数进行比较，以检验校准依赖性数值输出的差异，并为后续验证提供方法论基础。

二、研究方法概述

研究人员从韩国首尔的Genolution公司获取纯化的N. ceranae孢子悬液，并通过口服接种方式感染实验室饲养的新羽化工蜂，7天后收集感染蜜蜂用于实验。研究首先比较了三种前处理方法：过滤（F）、非过滤（NF）和非过滤加额外匀浆（NF-AH），以优化DNA提取效率。随后，采用自动化核酸提取系统Nextractor^? NX-32N进行DNA提取。qPCR反应靶向N. ceranae的Hsp70基因。校准曲线的构建采用了两种方法：一是使用重组质粒pMD20-hsp70的系列稀释液建立质粒标准曲线；二是将显微镜计数的孢子添加到未感染蜜蜂匀浆中，制备孢子标准曲线。研究最终使用9个经口接种获得的感染标本，其显微镜孢子负荷范围为9.3 × 10³至3.0 × 10⁶孢子/蜂，用于比较三种定量方法的结果。

三、研究结果

3.1 蜜蜂微孢子虫DNA提取前处理条件的初步评估

通过对同一复合匀浆液的等分试样进行配对比较，结果显示过滤组（F）与非过滤组（NF）的平均Ct值无统计学显著差异。相比之下，非过滤加额外匀浆组（NF-AH）的平均Ct值相比NF组降低了1.821个循环，表明额外匀浆显著提高了可扩增的N. ceranae DNA回收率。基于此，研究人员选择了省略过滤步骤并包含额外机械匀浆的非过滤工作流程用于后续实验。

3.2 N. ceranae感染qPCR校准条件的初步评估

基于质粒的标准曲线在10¹–10⁸拷贝范围内表现出优异的线性关系。对于孢子校准曲线，研究发现使用未稀释的DNA模板时无qPCR扩增信号，而稀释后信号恢复，这提示提取物中存在PCR抑制剂。在测试的稀释倍数中，10倍稀释（10^?1）显示出最佳的孢子数与Ct值之间的线性关系，而100倍和1000倍稀释则呈现出逐渐变浅的斜率和较低的确定系数。因此，10倍稀释被选为后续实验的标准模板DNA稀释条件。

3.3 使用不同样品评估微孢子虫感染水平

对9份感染标本的分析显示，三种定量方法的数值输出存在显著差异。所有两两比较均达到统计显著性。具体而言，孢子校准的qPCR估计值平均比显微镜计数高0.803 log₁₀单位。显微镜计数和孢子校准的qPCR估计值在数值上分别比质粒校准的DNA拷贝数输出高出2.014和2.817 log₁₀单位。显微镜计数与质粒校准的DNA拷贝数输出之间的几何平均数值比约为103。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，过滤步骤的省略有助于简化工作流程。额外匀浆步骤带来的DNA提取效率显著提升，归因于微孢子虫孢子壁极其坚固，仅靠初始匀浆不足以完全破坏，而更小的0.5mm玻璃珠提供了更强的物理剪切力。自动化磁珠提取系统的引入旨在标准化流程和减少人工操作，但其降低变异性和提高效率的优势在本研究中未被正式评估。未稀释DNA提取物无扩增而稀释后恢复的现象证实了PCR抑制剂的存在，10倍稀释被视为灵敏度和抑制缓解之间的合理折中。

重复测量分析揭示了三种定量方法间的数值差异。显微镜计数在数值上高于质粒校准的DNA拷贝数输出，但两者单位不同，不能直接建立分析准确性。孢子校准曲线是通过向未感染蜜蜂匀浆中添加计数的孢子制备的，而非感染组织的系列稀释，因此基质相关的抑制可能是校准依赖性差异的一个因素，但其贡献未被实验分离。其他潜在因素包括孢子破裂、提取回收损失、质粒浓度计算的不确定性以及靶标拷贝与寄生虫发育阶段的关系。显微镜和qPCR测量的是感染的不同组分：显微镜计数成熟的孢子，而qPCR检测可回收的靶标DNA，后者也可能来自细胞内发育阶段或细胞外物质。

研究结论翻译如下：本研究为候选的qPCR工作流程确定了有前景的样品处理和校准条件，该流程结合了省略过滤步骤并加入额外机械匀浆的前处理程序与自动化核酸提取系统。根据测试条件下的校准特性，选择了10倍稀释，但PCR抑制的完全消除尚未得到证实。校准方法的比较显示了在测试条件下数值输出的差异。然而，其在低感染负荷和预期测量范围上限的性能仍有待确定。因此，该工作流程应被视为一种候选方法，而非经过全面验证、适用于整个生物学相关感染强度范围的检测方法。