单细胞RNA测序中16种细胞多能性估算方法的分类框架、统一符号解析与系统性比较研究

《Cell Systems》：Categorization and analysis of 16 computational methods for estimating cell potency from single-cell RNA-seq data

从静态单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据中推断隐藏的细胞动态仍然是一个关键挑战。除了拟时间轨迹（pseudotime trajectories）和RNA速率（RNA velocities）之外，细胞多能性（cell potency）通过从基因表达水平估计细胞分化潜力，提供了另一种视角。研究人员综述了16种在不同且有时相互矛盾的假设下定义细胞多能性的计算方法。根据这些方法如何将基因表达汇总为多能性度量，研究人员将其分为基于平均（average-based）、基于熵（entropy-based）和基于知识（knowledge-based）的方法。通过使用统一的数学符号体系，研究人员详细阐述了这些方法的方法论，解释了类别内部和类别之间的关键相似性与差异，并总结了使用复杂性。鉴于方法的多样性，社区基准数据集（benchmark datasets）在单细胞分辨率下以及细致敏感性分析对于从多个角度评估方法并潜在地提高稳定性和泛化能力至关重要。本文为方法基准测试提供了基础，并强调了比较推断拟时间轨迹、RNA速率和细胞多能性的方法所面临的挑战。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术虽能在单细胞分辨率下解析基因表达，但仅提供静态快照，难以直接揭示细胞分化或重编程的动态过程。为从静态数据中推断隐藏的细胞动态，研究人员已开发出多种计算方法，主要包括拟时间轨迹（pseudotime trajectories）推断、RNA速率（RNA velocities）估算和细胞多能性（cell potency，亦称干性stemness）量化。其中，细胞多能性通过评估细胞产生不同命运及定向特定谱系的能力，从基因表达水平估计细胞的分化潜力，为理解发育过程提供了独特视角。然而，传统实验手段（如体外分化实验、畸胎瘤形成实验及谱系追踪）通常仅在细胞系或群体水平操作，成本高昂且难以规模化。尽管已有16种计算方法被开发用于从scRNA-seq数据量化单个细胞的多能性，但这些方法在基本假设、算法策略和实现细节上差异显著，且此前缺乏系统性的分类与比较。

为解决上述问题，研究人员对16种细胞多能性估计方法进行了系统的分类、数学标准化与比较分析。研究人员将这些方法依据其将基因表达量汇总为多能性度量的方式，划分为三大类：基于平均的方法（average-based methods，包括CytoTRACE、ORIGINS和NCG）、基于熵的方法（entropy-based methods，包括stemID、SLICE、dpath、scEnergy、cmEntropy、SCENT、MCE、SPIDE和stemFinder）以及基于知识的方法（knowledge-based methods，包括mRNAsi、CCAT、FitDevo和CytoTRACE2）。研究人员建立了一套统一的数学符号体系，涵盖基因×细胞计数矩阵（X ∈ ?^p×n≥0）、归一化表达矩阵（S ∈ ?^p×n≥0）、对数归一化矩阵（Z ∈ ?^p×n≥0）、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络邻接矩阵（A ∈ {0,1}^p×p）以及基因i的邻接基因集N(i)等，以此详细阐述各类方法的方法学原理、内部及类别间的关键相似性与差异，并总结其使用复杂性。该研究的意义在于为社区提供了方法基准测试的基础框架，并揭示了现有方法在推断拟时间、RNA速率和细胞多能性时面临的系统性比较挑战。

在方法学层面，研究人员采用文献系统综述与数学符号标准化相结合的策略，解构了各方法的计算流程。研究涉及的样本队列主要来源于各方法原始发表时使用的公开scRNA-seq数据集，包括CytoTRACE研究中使用的体外神经祖细胞（NPCs）、海马体不同时间点、斑马鱼早期胚胎、胸腺、子宫内膜、神经干细胞、少突胶质细胞、中脑节隆起、皮层中间神经元、完整涡虫及内胚层等单谱系数据集。此外，研究还使用了CCAT软件包提供的net17Jan16蛋白质-蛋白质相互作用网络作为参考网络，并采用CytoTRACE发表数据及Zenodo存档的公共数据进行分析。

研究结果

统一数学符号与概念框架
研究人员通过标准化数学符号，揭示了不同方法在概念定义与算法实现上的根本差异。基于平均的方法通过不同的汇总统计量将细胞基因表达简化为单一多能性数值；基于熵的方法则利用基因表达分布的均匀性或基因间状态转移的随机性构建度量；基于知识的方法则依赖于预定义的基因重要性评分或潜能相关基因集。

基于平均的方法（Average-based methods）
CytoTRACE假设细胞表达的基因数量（gene count）可反映分化状态。该方法首先筛选与基因计数最相关的200个基因，计算每个细胞的基因计数签名（GCS），经平滑处理后转换为秩次作为多能性估计。值得注意的是，研究人员发现CytoTRACE原始论文描述GCS为选定基因表达水平的几何平均，但其软件包实现实为对数表达水平的算术平均，且代码实现中的基因筛选流程（先基于离散度筛选1,000个基因再选择相关细胞）与论文描述存在程序性差异。ORIGINS将细胞多能性定义为蛋白质-蛋白质相互作用网络中所有边的细胞特异性权重之和，其中每条边的权重等于该边连接的两基因在细胞中对数归一化表达水平的乘积。NCG则综合蛋白质-蛋白质相互作用网络的拓扑结构（以加权边聚类系数EC_i量化）和基因本体（GO）术语的Kappa统计相似性，为基因分配权重后计算细胞加权表达总和。

基于熵的方法（Entropy-based methods）
stemID在细胞簇水平而非单细胞水平估计多能性，其干性评分定义为簇内细胞熵的中位数与最小中位数之差（ΔE_k）同该簇显著链接数（l_k）的乘积。SLICE通过对k-means聚类得到的基因组分子的表达比例计算熵，并通过对多个亚样本（B=100）取平均得到scEntropy。dpath利用加权非负矩阵分解（NMF）将对数转换后的TPM矩阵分解为元基因（metagenes）和细胞比例矩阵，通过细胞元基因比例的香农熵定义多能性。scEnergy基于绝对Spearman相关系数阈值（0.1）构建基因网络，通过计算归一化表达比例的对数熵估计潜能。cmEntropy直接基于计数矩阵计算单细胞Shannon熵。SCENT引入信号熵（signaling entropy），利用稳态概率（Π_ij）和基于蛋白质-蛋白质相互作用网络的基因间转移概率（P_ii′j）计算细胞潜能，其中归一化常数为邻接矩阵最大特征值λ的对数。MCE通过凸优化求解转移概率矩阵，使稳态概率满足约束条件，进而计算熵值，其归一化常数为log(∑d_i)。SPIDE与SCENT共享相似的熵公式，但引入了对数转换、分位数归一化、插补处理以及基于基因Pearson相关系数（R_ii′j）调整的邻接矩阵（A_j）和边权重（W_ii′j）。stemFinder则关注细胞周期基因在局部邻域内的异质性，通过二值化表达后的Gini不纯度量化，最终以1减去原始异质性分数作为多能性评分。

基于知识的方法（Knowledge-based methods）
mRNAsi利用一类logistic回归（OCLR）在bulk干细胞样本上预训练，提取基因系数作为重要性评分，通过Spearman相关计算新细胞的多能性。CCAT作为SCENT的快速代理，采用Pearson相关计算细胞对数归一化表达与蛋白质-蛋白质相互作用网络基因度数（degree）的相关性，在全局平均场假设下近似SCENT。FitDevo基于CytoTRACE发表的17个带有离散时间点标签的数据集，计算二值化基因权重（BGW），并结合用户数据的顶部主成分（PC）分数通过广义线性模型预测二值化基因权重（pBGW），将BGW与pBGW之和定义为样本特异性基因权重（SSGW），最终以Pearson相关估计潜能。CytoTRACE2采用神经网络架构，学习六个潜能类别对应的基因集二进制网络（GSBNs）和基因-背景基因映射矩阵，通过表达富集分数和秩次富集分数预测细胞潜能类别，并利用扩散过程平滑潜能分数（SPS），再经分箱（binned）和最近邻平滑后输出最终校准分数。

方法一致性与复杂性分析
研究人员通过比对各方法的原始论文描述与实际软件实现，发现部分存在算法细节差异。此外，通过雷达图比较16种方法在超参数总数、所需输入数量以及论文与实现差异数量三个维度的复杂性，揭示了各方法在使用门槛与实现一致性上的分布特征。

讨论部分与研究结论
在讨论中，研究人员指出当前领域面临的核心挑战之一是蛋白质-蛋白质相互作用网络的选择对多能性估计的影响。通过对CCAT、ORIGINS、NCG、SCENT和SPIDE进行网络节点标签随机置换的敏感性分析，研究人员发现CCAT的多能性估计在高达70%节点置换后仍保持稳定，而其他依赖网络的方法则随扰动增加呈现准确性下降趋势，提示这些方法所利用的网络信息贡献程度及其生物学信号所在的扰动阈值尚不明确。针对CytoTRACE的核心假设，研究人员构建了基于细胞文库大小（library size）而非基因计数选择基因的变体，并在12个单谱系数据集上评估，发现其性能与原方法相当，表明在当前框架下基因计数与文库大小的贡献难以解耦。此外，研究人员以CCAT为例评估了不同归一化策略对结果的影响，发现采用PFlogPF归一化可获得与ground-truth略高的Spearman相关性，提示针对多能性估计任务优化数据预处理流程具有提升性能的空间。研究人员强调，目前该领域缺乏单细胞分辨率的真实多能性标签，现有基准主要依赖群体水平的分化时序或细胞类型标签，存在分辨率错配；同时，16种方法的内部评估显示跨数据集性能差异显著，其驱动因素仍有待阐明。在边界情境（如单能细胞系、有丝分裂后细胞）及多能干细胞（PSC）谱系特异性扰动模型中，现有方法的表现仍属未知，且当前评分在不同数据集、组织或扰动条件下的可比性尚未确立。研究人员认为，整合特征明确的基因调控网络（GRN）、细胞-细胞相互作用信息及单细胞转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）数据，并联合谱系追踪（lineage-tracing）实验建立单细胞分辨率基准，是提升多能性估计可靠性与发现新型潜能标记基因的关键方向。