《Genes》：Molecular and Cellular Characterization of Core Genes Associated with Endoplasmic Reticulum Stress in Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury
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背景：心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI）是再灌注治疗后加重心肌损伤的重要因素，对临床预后产生不利影响。内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）作
背景：心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI）是再灌注治疗后加重心肌损伤的重要因素，对临床预后产生不利影响。内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）作为一种关键的细胞应激反应机制，在MIRI的发生发展中发挥核心调控作用。目前，ERS相关核心基因调控MIRI的分子通路和细胞表型特征尚未完全阐明。针对这一领域的靶向研究可为开发新型心肌保护策略提供坚实的理论基础。方法：本研究从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中获取了两个微阵列基因表达数据集（GSE100499和GSE108940）。同时，从GeneCards和Molecular Signatures Database（MSigDB）数据库收集了ERS相关基因。利用limma包鉴定差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），并通过加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）筛选关键模块基因。对DEGs、选定的WGCNA模块基因以及ERS相关基因进行交集分析。采用三种机器学习算法——最小绝对值收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）、随机森林（Random Forest, RF）和支持向量机（Support Vector Machine, SVM）——来识别核心ERS基因；通过功能关联分析探索核心基因之间的潜在关系。同时，进行单细胞核RNA测序分析，在单细胞水平探究核心基因的功能机制。此外，通过构建大鼠MIRI模型和H9c2细胞缺氧复氧模型，并使用4-苯基丁酸（4-phenylbutyrate, 4-PBA）抑制ERS，验证了这些核心基因在MIRI中的病理作用。结果：ERS相关的DEGs主要富集于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）信号通路、脂质代谢与动脉粥样硬化以及白细胞跨内皮迁移通路，这些都是MIRI进展中的关键病理通路。四个ERS相关基因（Bcl2、Thbs1、Cebpb和Calr）在LASSO、RF和SVM分析中表现最佳。这四个基因均显示出与MIRI和ERS相关通路的显著相互作用，包括ERS激活、炎症反应、心肌细胞凋亡和炎性细胞迁移。在MIRI心脏组织的单细胞转录组中，在12种细胞类型里，上述四个基因主要在心肌细胞、血管内皮细胞和心脏巨噬细胞中上调。值得注意的是，心肌细胞和心脏巨噬细胞表现出明显的促炎状态和最高的焦亡水平。这表明它们可能是四个关键基因介导MIRI相关损伤的主要效应细胞。结论：综上所述，Bcl2、Thbs1、Cebpb和Calr可能作为MIRI潜在的ERS相关生物标志物和治疗靶点，为ERS介导的心肌损伤分子机制提供了新的见解。
研究背景与现存问题
心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是指在缺血缺氧后恢复血液灌注时，心肌组织病理改变反而加重的一种现象。在急性心肌梗死的临床治疗中，经皮冠状动脉介入治疗和溶栓等再灌注疗法虽能挽救缺血心肌，但不可避免地会诱发MIRI，导致心肌细胞进一步坏死、心功能恢复延迟，甚至引发恶性心律失常或心力衰竭，严重影响患者预后。MIRI的潜在机制已被发现多种，包括过度炎症反应、大量活性氧（ROS）积累造成的氧化损伤、心肌细胞凋亡/坏死、线粒体功能障碍和血管内皮功能障碍等。内质网（ER）在维持心肌细胞的蛋白质和钙稳态中起着至关重要的作用。心肌缺血期间，氧气和营养物质的缺乏会损害ER的蛋白质折叠能力并扰乱细胞内钙稳态，导致未折叠或错误折叠蛋白的积累，从而激活内质网应激（ERS）。随后的再灌注虽然对于恢复心肌血供必不可少，但会通过过量ROS产生、钙超载和炎症激活进一步加剧细胞应激。因此，ERS可能参与缺血期和再灌注期的心肌损伤。目前，临床上预防或减轻MIRI的方法包括缩短心肌缺血时间、使用抗氧化剂和抗炎药物以及采用缺血预适应/后适应等，但这些方法的保护效果有限，无法完全阻断MIRI进程，存在未满足的临床治疗需求。针对ERS相关核心基因调控MIRI的分子通路和细胞表型特征的研究尚不充分，为此，研究人员整合了整体转录组和单细胞核RNA测序数据集，旨在系统性地阐明ERS在MIRI中的分子机制。
研究方法概述
研究人员首先从GEO数据库获取了两个微阵列基因表达数据集（GSE100499，包含4个大鼠假手术样本和4个大鼠MIRI样本；GSE108940，包含12个小鼠假手术样本和12个小鼠MIRI样本），共计32个表达谱。同时从GeneCards和MSigDB数据库收集了ERS相关基因。利用limma包筛选差异表达基因（DEGs），通过WGCNA分析确定与MIRI表型最相关的关键模块基因。将DEGs、WGCNA模块基因与ERS相关基因取交集，得到33个ERS相关DEGs。随后运用LASSO、随机森林（RF）和支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）三种机器学习算法筛选核心基因。利用GeneMANIA构建核心基因互作网络，并通过Nomogram模型和ROC曲线评估其诊断价值。使用CIBERSORT分析免疫微环境浸润特征。为进一步在单细胞水平验证，研究人员从GEO获取了单细胞核RNA测序数据（GSE227088，含3个假手术和3个MIRI小鼠样本），通过Seurat进行降维聚类和细胞注释，利用CellChat分析细胞间通讯，并使用GSVA评估通路活性。最后，通过建立大鼠MIRI体内模型（30只SD大鼠，随机分为假手术组、I/R组和I/R+4-PBA干预组）和H9c2心肌细胞体外缺氧复氧（H/R）模型进行实验验证。
研究结果
3.1 数据预处理与DEGs筛选
通过对32个心脏基因表达谱进行数据预处理和批次效应校正后，研究人员利用limma包进行差异表达分析，共鉴定出1811个DEGs，其中包括675个上调基因和1136个下调基因。
3.2 WGCNA共表达网络分析与关键模块识别
层次聚类显示无异常离群样本。软阈值分析确定β=5为合适的网络构建参数。动态树切算法识别出9个共表达模块，其中洋红色模块与MIRI表型的相关性最强（r=0.74, p<0.05），该模块包含199个基因。
3.3 ERS-DEGs鉴定与功能富集分析
将洋红色模块中的199个基因与MIRI相关DEGs及ERS相关基因取交集，获得33个重叠的ERS相关DEGs。GO功能富集分析显示这些DEGs富集于ERS反应和内源性凋亡通路调控等生物学过程。KEGG通路富集结果表明这些基因主要聚集在MIRI的核心病理通路中，包括TNF信号通路、脂质与动脉粥样硬化以及白细胞跨内皮迁移。
3.4 核心基因筛选与关键特征分析
应用三种机器学习算法从33个ERS相关DEGs中筛选核心基因。LASSO回归确定了7个非零系数基因，随机森林保留了12个候选基因，SVM-RFE识别出11个候选基因。三者取交集后得到4个共同基因：Bcl2、Thbs1、Cebpb和Calr。在两个数据集中，Cebpb、Thbs1和Calr在MIRI样本中表达升高，而Bcl2表达降低。
3.5 核心基因功能预测与分子机制探索
基于四个核心基因构建的Nomogram风险预测模型展现出优秀的预测准确性。GeneMANIA构建的基因互作网络显示这些基因的功能集中在凋亡信号通路正调控、ERS诱导的内源性凋亡信号通路和未折叠蛋白反应（UPR）等生物学过程。ROC曲线分析显示Bcl2（AUC=0.871）、Thbs1（AUC=0.938）、Calr（AUC=0.840）和Cebpb（AUC=0.984）具有良好的诊断效能。单基因GSEA分析揭示了高表达组与低表达组之间的双向富集模式。
3.6 免疫微环境浸润特征分析
CIBERSORT分析估计了22种免疫细胞在MIRI和对照组心肌组织中的相对比例。经Benjamini-Hochberg（BH）校正后，仅活化肥大细胞在两组间显示出统计学显著差异。Spearman相关性分析显示Bcl2表达与初始B细胞、活化肥大细胞和活化CD4+记忆T细胞呈正相关，Calr表达与静息自然杀伤细胞呈正相关，但经多重比较校正后这些相关性均未达到统计学显著性。
3.7 核心基因的细胞特异性表达的单细胞转录组分析
经过Harmony整合和降维后，研究人员鉴定了22个转录上不同的簇，并将其注释为12种心脏细胞群体。CellChat分析显示MIRI样本中巨噬细胞和成纤维细胞之间存在显著的预测相互作用。UMAP特征图展示了四个核心基因在假手术和MIRI条件下的细胞分布情况。GSVA进一步揭示了不同细胞群体间的通路活性差异。
3.8 体内大鼠实验验证
在大鼠MIRI模型中，与I/R组相比，I/R+4-PBA组的LVEF和LVFS显著改善，血清中心肌损伤标志物CK-MB和LDH以及炎症因子IL-18、IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著降低。TTC染色显示I/R+4-PBA组心肌梗死面积明显减小。H&E染色显示I/R+4-PBA组心肌纤维排列更规则，炎症浸润和水肿显著减少。IHC结果显示，与I/R组相比，I/R+4-PBA组Bcl-2表达显著增加，而Thbs1和CHOP表达降低。TUNEL结果显示I/R+4-PBA组凋亡率显著降低。Western blot分析证实，与I/R组相比，I/R+4-PBA组心肌组织中BCL-2蛋白表达显著增加，而THBS1、CALR和C/EBPβ蛋白丰度显著降低。
3.9 4-PBA减轻H9c2细胞缺氧/复氧损伤并调节ERS相关蛋白表达
在H9c2细胞H/R模型中，CCK-8测定确定2mM为4-PBA的最佳浓度，可显著提高细胞活力。划痕愈合实验显示I/R+4-PBA组细胞迁移能力显著增强。流式细胞术分析表明4-PBA干预显著降低了H/R诱导的细胞凋亡。免疫荧光染色显示I/R+4-PBA组BCL-2荧光强度显著增强。Western blot分析证实，与H/R组相比，4-PBA处理增加了BCL-2蛋白丰度，同时降低了THBS1、CALR和C/EBPβ的蛋白水平。
讨论与结论
研究人员指出，本研究鉴定的四个核心基因（Bcl2、Thbs1、Cebpb和Calr）代表了MIRI反应的不同方面：BCL-2主要与细胞存活控制相关，THBS1涉及基质细胞和炎症重塑，C/EBPβ是应激反应性转录调节因子，CALR则参与ER蛋白质质量控制和钙稳态。这种功能多样性对于MIRI具有重要意义，因为心肌细胞死亡伴随着线粒体功能障碍、炎症激活、血管紊乱和组织重塑。研究人员强调，尽管这四个基因各自都曾被认为与心肌损伤有关，但通过转录组分析、机器学习、单细胞核转录组学和实验验证的综合表征，本研究提供了对MIRI中ERS相关分子变化的更广泛理解。因此，本研究的贡献在于对功能不同的候选基因进行整合表征，而非单个基因的首次发现。研究人员还讨论了各基因的生物学意义及其与MIRI的关系，并指出了研究中存在的局限性，包括发现数据集在物种、实验设计和样本结构上的差异，有限的独立生物样本数量可能影响分析的稳定性；单细胞核转录组分析描述了候选基因的细胞分布但未建立其在特定心脏细胞群体中的功能作用；4-PBA在缺血前给药且具有多种药理作用，其保护作用不能完全归因于再灌注期间的ERS抑制；以及实验验证主要在大鼠心肌组织和H9c2细胞中进行，缺乏人心肌样本或前瞻性临床验证。
研究结论： 综上所述，Bcl2、Thbs1、Cebpb和Calr可能作为MIRI潜在的ERS相关生物标志物和治疗靶点，为ERS介导的心肌损伤分子机制提供了新的见解。
