# 基于细胞器基因组的栎属（*Quercus*）比较分析揭示截然不同的进化动力学

《Genes》：Comparative Analyses of the Organellar Genomes of Quercus Reveal Contrasting Evolutionary Dynamics

　　

背景：植物线粒体基因组与叶绿体基因组由于在基因组组织、功能约束和基因组维持机制上的差异，经历了不同的进化轨迹。然而，关于栎属（*Quercus*）细胞器基因组进化动力学的比较研究仍然有限。方法：利用 PacBio HiFi 测序读长对*Quercus arbutifolia*的完整线粒体基因组与叶绿体基因组进行组装与注释。对基因组结构、重复序列、密码子使用以及线粒体-质体DNA转移（mitochondrial plastid DNA transfers，MTPTs）进行了表征。在选取的*Quercus*物种间开展进化基因组学与系统发育分析，以评估结构变异、序列分歧和系统发育关系。结果：*Q. arbutifolia*的线粒体基因组被组装为 493,735 bp 的线状分子，而叶绿体基因组被组装为 160,682 bp 的环状分子。线粒体基因组表现出较低的编码密度和较高的重复序列丰度。两种细胞器基因组均偏好使用以 A/U 结尾的密码子，密码子使用变异与突变偏倚及选择约束相关。鉴定出 32 个 MTPT 区域，主要为质体向线粒体的转移。叶绿体基因组在*Quercus*物种间显示出保守的反向重复（IR）边界，而线粒体基因组则表现出广泛的结构重排，表明两种细胞器基因组之间存在截然不同的进化动力学。核苷酸多样性分析进一步揭示两种细胞器基因组之间存在不同的序列变异，叶绿体蛋白编码基因（PCGs）通常表现出高于线粒体 PCGs 的序列分歧。系统发育分析恢复了主要*Quercus*谱系之间基本一致的关系，但存在若干谱系特异性冲突。结论：总体而言，*Q. arbutifolia*的线粒体基因组与叶绿体基因组在基因组结构和序列进化上表现出截然不同的模式。二者基本一致但部分冲突的系统发育信号，为研究*Quercus*细胞器基因组进化与多样性分化提供了互补性信息。

# 栎属（*Quercus*）细胞器基因组比较分析揭示的进化动力学差异

## 一、研究背景与科学问题

植物线粒体基因组与叶绿体基因组均起源于远古内共生事件，并在真核细胞演化过程中保留了半自主遗传系统，但二者在陆生植物中确立后经历了显著不同的进化轨迹。叶绿体基因组通常基因内容高度保守、结构相对稳定，维持由大单拷贝区（large single-copy region，LSC）、小单拷贝区（small single-copy region，SSC）和两个反向重复区（inverted repeats，IRs）构成的环状四分体结构；而植物线粒体基因组在基因组大小、组织结构、非编码序列组成及结构重排方面表现出极大的多样性。然而，在序列层面，植物线粒体基因组进化通常远慢于叶绿体基因组，在种子植物中线粒体同义替换率一般仅为叶绿体的三分之一至九分之一，这种"结构快速进化而序列缓慢进化"的表观矛盾成为植物线粒体基因组进化的核心问题之一。

叶绿体基因组因保守性已被广泛用于植物系统发育重建、物种鉴定与进化研究，而线粒体基因组研究长期滞后，主要受制于其组装难题：植物线粒体基因组常富含重复序列、重排模式复杂、具异质性结构并含有大量外源DNA，传统短读长测序难以完整重建。长读长测序技术尤其是PacBio HiFi测序的发展，通过产生可解析重复区与结构变异的高准确度读长，显著改善了复杂线粒体基因组的重建。此外，同一进化谱系内线粒体与叶绿体基因组的比较为理解植物细胞器基因组的不对称进化模式提供了重要框架，但二者整合分析仍相对有限，尤其在木本植物谱系中尚缺乏对细胞器基因组进化的全面评估。

壳斗科（Fagaceae）是北半球广泛分布的重要木本被子植物类群，其中栎属（*Quercus*）是物种最丰富、进化最复杂的类群之一，具有广泛的形态变异、快速多样化和频繁的历史渐渗。已有基于核基因与叶绿体标记的系统发育研究揭示了*Quercus*复杂的进化历史，包括谱系分化、杂交和叶绿体捕获事件，但与核基因组和叶绿体基因组相比，*Quercus*线粒体基因组研究仍十分薄弱。*Quercus arbutifolia*是东亚亚热带特有的常绿栎类，仅分布于海拔1000–2000 m的高度破碎化山地云雾林（montane cloud forests，MCFs）中，其基因组资源尤其是线粒体基因组信息有限。为此，研究人员利用PacBio HiFi测序组装并表征了*Q. arbutifolia*的完整线粒体与叶绿体基因组，围绕基因组结构、基因内容、重复序列图谱、线粒体-质体DNA转移、序列分歧及系统发育关系开展综合分析，旨在：（1）表征两种细胞器基因组的结构组织、基因内容与进化模式；（2）探究促成线粒体基因组复杂性及结构多样化的基因组因素，包括重复序列积累与外源DNA获得；（3）比较线粒体与叶绿体基因组的进化速率与系统发育信号，以更好地理解*Quercus*内细胞器基因组进化。

## 二、主要关键技术方法

研究人员采集*Q. arbutifolia*自然种群的新鲜健康叶片，液氮冷冻保存，凭证标本存于上海辰山植物园辰山植物标本馆（CSH）；采用改良CTAB法提取基因组DNA，经电泳、NanoDrop One与Qubit 3.0检测质量与浓度后，构建无PCR的SMRTbell文库，在PacBio Revio平台进行单分子实时（SMRT）测序，保留HiFi读长作为clean data。利用HiMT v1.1.0同时组装两种细胞器基因组，分别以PMGA v1.0与GeSeq v2.03注释并人工校对，OGDRAW v1.3.1绘制基因组图谱。采用MISA v2.1、Tandem Repeats Finder（TRF）v4.09与Vmatch v2.3.1鉴定简单序列重复（SSRs）、串联重复与长重复，CodonW v1.4.2计算相对同义密码子使用度（RSCU）、GC1/GC2/GC3与有效密码子数（ENc）。利用"transgenomes"R包结合BLASTN v2.17.0鉴定线粒体-质体DNA转移事件。选取已发表的相关*Quercus*物种细胞器基因组（表S1）统一重注释后，以NGenomeSyn v1.41进行线粒体全基因组比对与共线性分析，以CPJSdraw v1.0分析叶绿体IR扩张收缩，以CPStools v3.0计算单基因核苷酸多样性（π）。以*Fagus sylvatica*为外类群，基于共享蛋白编码基因（PCGs）用MAFFT v7.487比对、trimAl v1.4过滤，IQ-Tree v3.0.1以最大似然（ML）法建树，ModelFinder按贝叶斯信息准则（BIC）选模型，1000次超快自举与1000次SH-aLRT评估分支支持率，FigTree v1.4.4可视化。

## 三、研究结果

**3.1 细胞器基因组基本特征**：通过组装与注释发现，*Q. arbutifolia*线粒体基因组为493,735 bp的线状序列，GC含量45.81%；叶绿体基因组为160,682 bp的典型环状结构，GC含量较低（36.91%）。线粒体基因组编码序列（CDS）长29,495 bp，仅占总基因组5.97%，而叶绿体基因组含79,786 bp编码序列，占49.78%。两种基因组均含保守的PCGs、tRNA与rRNA基因集：线粒体共鉴定62个基因，包括39个PCGs、20个tRNA与3个rRNA基因，去除重复拷贝后保留58个唯一基因，含11个含内含子基因（8个顺式剪接、3个反式剪接）；叶绿体含131个基因，包括86个PCGs、37个tRNA与8个rRNA基因，鉴定出113个唯一基因，其中23个含内含子（21个顺式剪接、2个反式剪接）。

**3.2 重复序列**：通过重复序列鉴定发现线粒体基因组的重复序列丰度显著高于叶绿体，尤其长重复。线粒体共鉴定159个SSRs，以四核苷酸重复最多（60个，37.7%），其次为单核苷酸（41个，25.8%）与二核苷酸（34个，21.4%），广泛分布并形成多个重复簇；检测到12个串联重复和397个长重复（239个正向重复、158个回文重复），广泛分布于整个基因组。叶绿体仅含119个SSRs，以单核苷酸重复为主（69.7%），四核苷酸重复较少（11个，9.2%），主要分布于LSC与SSC区；另检测到34个串联重复和40个长重复（17个正向、23个回文），丰度较低且分布更受限，主要位于基因间区。

**3.3 密码子使用模式**：通过RSCU、ENc与GC含量分析发现，两种细胞器基因组均明显偏好A/U结尾的同义密码子。线粒体基因组有29个同义密码子RSCU>1，以GCU（Ala，1.53）、UAU（Tyr，1.51）和CAU（His，1.49）最高；叶绿体偏好更强，31个密码子RSCU>1，尤以UUA（Leu，1.95）和AGA（Arg，1.85）突出。ENc-plot分析显示二者ENc值主要分布于40–60之间，密码子使用偏倚较弱，多数基因偏离预期ENc-GC3s曲线，提示仅突变偏倚不足以解释观察到的模式，选择约束亦有贡献；线粒体基因GC3s变异范围更宽、分布更分散，提示核苷酸组成与密码子使用异质性更大。Neutrality-plot分析中，叶绿体GC3与GC12呈弱正相关（y = 0.282x + 35.08，R² = 0.040），线粒体呈弱负相关（y = ?0.054x + 46.98，R² = 0.008），低相关系数提示第三密码子位点变异对第一、二位点核苷酸组成影响有限，密码子使用更多受选择影响。

**3.4 线粒体-质体DNA转移事件（MTPTs）**：通过"transgenomes"R包检测发现，线粒体与叶绿体基因组间共鉴定32个同源转移区域，长度51–2393 bp，序列一致性81.25–99.79%，总长13,771 bp，约占线粒体基因组2.79%和叶绿体基因组8.57%。其中24个为质体向线粒体（PT→MT）转移，仅1个为线粒体向质体（MT→PT）转移，其余7个方向未定，主要涉及高度保守的细胞器基因或短同源序列；唯一的MT→PT事件位于涉及ccmC与trnI-CAU的短区域。PT→MT转移中PCG转移主要涉及rps12、atpA、atpF、psbB、psbC、psbD、psbT、ndhD与ndhE片段；rRNA基因间（线粒体rrn18与质体rrn16）检测到广泛同源区；另鉴定出trnA-UGC、trnF-GAA、trnH-GUG、trnI-CAU、trnI-GAU、trnM-CAU、trnN-GUU、trnP-UGG、trnQ-UUG与trnV-GAC等tRNA序列，部分序列一致性极高。GC含量比较显示两组分布大致相似，Wilcoxon秩和检验无显著差异（p = 0.867）。

**3.5 比较结构进化**：通过跨*Quercus*物种比较发现，叶绿体基因组IR边界总体保守，IR长度介于25,817–25,871 bp，差异仅54 bp；位于边界区的rps19、rpl2、trnN、trnH、ycf1与ndhF基因仅出现1–53 bp的轻微位置移动，表明叶绿体基因组在*Quercus*进化中结构分歧有限。相反，线粒体基因组在*Quercus*物种间表现出广泛结构重排，全基因组共线性分析显示其共享大量同源区但重排模式复杂，包括共线区块碎片化、倒位及保守区相对位置改变，共线性显著降低，结构可塑性更高，表明两种细胞器基因组进化动力学截然不同。

**3.6 细胞器基因核苷酸多样性**：通过比较PCGs、rRNA与tRNA基因的核苷酸多样性（Pi）发现，PCGs平均Pi在叶绿体基因组（0.0030）中高于线粒体基因组（0.0020），表明所采样叶绿体PCGs平均核苷酸多样性更高；rRNA基因在两种基因组中均保持持续较低的核苷酸多样性，反映其强进化保守性。整体上两种细胞器基因组核苷酸多样性存在差异，凸显了*Quercus*物种间序列变异水平的差异，为比较线粒体与叶绿体基因的系统发育信号提供了基础。

**3.7 *Quercus*物种间系统发育关系**：通过基于共享线粒体PCGs与叶绿体PCGs分别开展最大似然分析发现，两种系统树在若干主要谱系上拓扑高度相似，与*Quercus*现行分类大体一致；叶绿体树在多数内部枝上分辨率和支持值总体高于线粒体树。组Cyclobalanopsis物种（*Q. gilva*、*Q. litseoides*与*Q. arbutifolia*）在两种树中均形成支持度高的独立谱系，其中*Q. arbutifolia*与*Q. litseoides*始终为姐妹种，*Q. gilva*为该组最早分化谱系；*Q. variabilis*、*Q. chenii*与*Q. acutissima*的密切关系在两种数据中均获支持，但分支顺序略有差异；组Quercus物种（*Q. petraea*与*Q. robur*）在两种树中关系最为一致，均以高支持率（BS = 100）互为姐妹种。同时观察到若干拓扑不一致，最显著的是组Ilex：线粒体树中*Q. ilex*与*Q. agrifolia*为姐妹类群，而叶绿体树中*Q. ilex*在所采样*Quercus*物种中占据独立的基部位置；此外*Q. tungmaiensis*与*Q. engleriana*在两种数据集中的系统位置不同，提示线粒体与叶绿体基因组对某些*Quercus*谱系保留了不同的进化历史。

## 四、讨论与结论

讨论部分围绕三个方面展开。其一，重复序列与DNA转移事件共同促成线粒体基因组复杂性：*Q. arbutifolia*线粒体基因组富含重复序列与大量质体来源序列，重复序列（尤其长重复）为同源重组提供底物，可产生基因组重排、替代分子构型与结构多样化；两种基因组SSR组成差异（线粒体以四核苷酸重复居多，叶绿体以单核苷酸重复为主）可能反映不同的突变环境与选择约束，SSRs亦可作为候选分子标记用于*Quercus*遗传多样性、种群结构与谱系地理研究，但其多态性与适用性尚需多居群验证；32个同源转移区中以PT→MT为主的方向偏倚在被子植物线粒体基因组中普遍存在，提示线粒体基因组常作为外源DNA的接受者，多数转移序列插入后不太可能保留独立功能，但其存在为细胞器基因组间的历史互作提供了证据。其二，两种基因组在基因组大小、编码密度、密码子使用与核苷酸多样性上存在分化特征：叶绿体基因组因基因顺序与基因组完整性的强功能约束而维持高度保守结构，线粒体基因组则耐受广泛扩张与结构变异；两种基因组对A/U结尾密码子的共同偏好是植物细胞器基因的普遍特征，而ENc-plot与Neutrality-plot分析提示选择约束亦参与塑造密码子偏好；叶绿体PCGs平均核苷酸多样性高于线粒体PCGs，提示所采样*Quercus*物种间叶绿体基因序列分歧相对更快，若干变异较高的基因（如线粒体sdh4与叶绿体rpl22）可开发为DNA条形码；这些差异可能由DNA修复与重组、功能约束差异以及自然选择与遗传漂变等多种互作过程塑造，尚无单一假说能完全解释植物线粒体与叶绿体基因组的不同突变模式。其三，两种细胞器基因组为*Quercus*提供互补的进化信号：两种系统树总体一致，支持细胞器基因组在解析近缘栎类关系上的可靠性，但组Ilex等谱系的不一致可能源于不完全谱系分选（incomplete lineage sorting，ILS）、渐渗与杂交、叶绿体捕获或细胞器遗传方式差异，其相对贡献尚未解决；细胞器不一致可为历史进化事件提供有价值的信息而非单纯的系统发育不确定性，因此整合细胞器基因组可避免仅依赖单一基因组区室的结论，未来结合线粒体、叶绿体与核基因组数据及更广泛居群采样，对解析*Quercus*网状进化历史与适应性多样化十分必要。

结论部分译文：本研究对*Q. arbutifolia*的线粒体基因组与叶绿体基因组进行了全面的比较分析，并探讨了其在*Quercus*内截然不同的进化模式。结果表明，*Q. arbutifolia*的线粒体基因组与叶绿体基因组表现出高度对比的进化动力学。叶绿体基因组维持以稳定IR边界和相对有限结构变异为特征的保守架构，而线粒体基因组则表现出由重复序列、基因组重排和频繁的质体来源DNA获得所驱动的广泛结构可塑性。密码子使用、核苷酸多样性与系统发育信号的差异模式进一步表明，两种细胞器基因组经历了不同的进化约束。这些发现为*Quercus*细胞器基因组进化提供了新见解，并强调了整合线粒体与叶绿体基因组信息对于理解植物进化多样化的重要性。