## 一、专业标题 广东快乐十分

《Genes》：Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the Aquaporin Gene Family in Plum (Prunus salicina) in Relation to Fruit Cracking

　　

## 三、摘要翻译

**背景**：水通道蛋白（aquaporins，AQPs）在植物水分运输与胁迫响应中发挥关键调控作用。本研究旨在系统鉴定李（Prunus salicina）AQP基因家族，阐明其进化特征，并分析其在果实裂果（fruit cracking）过程中的表达模式，从而为进一步的功能鉴定奠定基础。**方法**：利用'三华李'（'Sanyueli'）与'五月脆'（'Wushancuili'）的全基因组序列，通过BLAST同源检索与HMMER谱分析相结合的策略鉴定AQP家族成员。开展生物信息学分析以考察系统发育、基因结构及启动子顺式作用元件。此外，采用qRT-PCR（quantitative real-time PCR）定量分析候选基因在裂果与正常果实不同组织中的相对表达水平。**结果**：在'三华李'与'五月脆'基因组中分别鉴定到28个与31个AQP成员，可划分为5个进化亚家族。启动子分析显示脱落酸（abscisic acid，ABA）与茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）响应元件显著富集。qRT-PCR结果表明，AQP成员在响应裂果时表现出组织特异性与品种特异性表达模式，其中果皮中表达水平显著较高。**结论**：本研究首次对P. salicina AQP基因家族进行系统鉴定与表征，揭示其在裂果胁迫中的潜在调控作用。上述发现为进一步理解李AQP的转录调控机制与功能分化奠定了理论基础。

## 四、论文主体解读

**研究背景与问题**：植物生长发育依赖体内严格的水分运输与调节，果实发育期的水分吸收是影响果实裂果的关键因素。果实吸水主要通过维管系统完成，因此介导跨膜水分运输的水通道蛋白（aquaporins，AQPs）在植物水分关系中尤为重要。AQPs为含主要内在蛋白（major intrinsic protein，MIP）结构域的小型膜内在蛋白，据拟南芥中氨基酸序列同源性与亚细胞定位可划分为质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）、液泡膜内在蛋白（tonoplast intrinsic proteins，TIPs）、类根瘤菌26内在蛋白（nodulin-26-like intrinsic proteins，NIPs）、小型内在蛋白（small intrinsic proteins，SIPs）与类GIP蛋白（GIP-like proteins，GIPs）五个亚家族，其后又在Sphaerotheciella sphaerocarpa中发现未分类X内在蛋白（uncategorized X intrinsic proteins，XIPs）与杂合内在蛋白（hybrid intrinsic proteins，HIPs）。在番茄、荔枝与甜樱桃的多组学分析中已发现多个AQP基因与裂果调控相关。李（P. salicina Lindl.）因果实丰满圆润、富含维生素、有机酸与矿物质而深受消费者青睐，但迄今尚无关于李AQP基因家族的全基因组研究。2020年首个中国李基因组测序项目的完成，为AQP家族的全基因组分析提供了基础材料。

**研究开展与结论**：研究人员基于'三华李'与'五月脆'两个代表性品种的参考基因组，鉴定水通道蛋白基因家族成员，分析其理化性质、系统发育、基因结构、染色体定位、共线性、启动子顺式作用元件与蛋白互作网络，并表征这些AQPs在不同李品种不同裂果状态下的表达模式，为深入研究其响应非生物胁迫的潜在作用提供了重要依据。研究共鉴定到'三华李'28个、'五月脆'31个AQP成员，启动子区ABA与MeJA响应元件显著富集，提示其可能通过激素信号途径参与胁迫响应；表达分析表明AQP成员在裂果过程中表现出品种特异性与组织特异性，果皮中转录本显著下调，提示其在转录水平上对裂果胁迫具有潜在调控作用。该研究为深入解析李AQP基因家族的转录调控机制及其在果实发育与裂果响应中的功能分化提供了重要理论基础。

**关键技术方法**：以拟南芥35条与番茄48条AQP蛋白序列为参考，经TBtools（v2.439）进行BLAST同源检索（E值<1×10^?5）并结合Pfam数据库（PF00230）隐马尔可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）检索，取交集后用SMART在线工具验证MIP超家族保守域与跨膜结构域；用MEGA12.0以ClustalW进行多序列比对、最大似然法（Maximum Likelihood，ML，bootstrap=1000）构建系统发育树；用MCScanX进行全基因组共线性分析；用MEME预测保守基序、NCBI CD-Search预测保守结构域；用PlantCARE预测启动子顺式作用元件；基于STRING数据库（拟南芥为参考物种，分类ID 3702）预测蛋白互作网络。表达分析材料为广西地方优良品种'三华'李（P. salicina Lindl. cv. 'Sanhua'，SHL）与'五月脆'李（P. salicina Lindl. cv. 'Wuyuecui'，WYC），采样点位于广西恭城县城厢镇门楼村（110°44′52″ E，24°51′36″ N，海拔172 m）与广西全州县庙头镇大堆门村（111°13′4″ E，26°11′12″ N，海拔160 m），选取6年生健壮树（株行距5.0 m×4.0 m），于果实转色期（花后70天）晴天无雨时分别采集正常果（果皮完整光滑、无可见裂纹）与裂果（果皮有明显可见裂口），仅选取中等裂果程度（局部清晰裂口、组织轻微分离但无大面积果肉外露）的果实；每株采正常果与裂果各10个，以单株为生物学重复，试验重复3次；果皮（赤道部均匀切取约1–2 mm厚，避开果梗洼与萼端）与果肉（约5 mm厚）分别液氮速冻研磨后提取总RNA，以Actin为内参基因进行qRT-PCR，采用2^?ΔΔCT法计算相对表达量，SPSS 26.0独立样本t检验进行显著性分析（p<0.05）。

**研究结果**：

3.1 李AQP基因家族的鉴定与基本信息：通过全基因组比对结合SMART数据库验证，在'三华李'与'五月脆'基因组中分别鉴定到28个与31个AQP家族成员。'三华李'成员氨基酸长度为55–328 aa，分子量5782.93–35,461.64 Da，理论等电点（pI）4.56–10.01，多数为碱性（pI>7），含6个酸性、1个中性成员；全部为稳定蛋白（不稳定指数<40），脂肪族指数78.07–118.71，均为疏水性（GRAVY>0）。'五月脆'成员氨基酸长度122–307 aa，分子量12,820.1–32,075.85 Da，pI 4.86–10.01，10个为酸性蛋白、21个为碱性；全部为稳定蛋白，脂肪族指数90.8–126.39，均为疏水性。全部成员符合AQP膜蛋白特征。亚细胞定位预测显示两个品种AQP成员主要定位于质膜（'三华李'19个、'五月脆'24个），少数分布于叶绿体与液泡等细胞器，符合典型AQP亚细胞分布模式。

3.2 李AQP家族成员系统发育树的构建：利用MEGA12构建含'三华李'、'五月脆'、拟南芥与番茄AQP基因家族的系统发育树，参照拟南芥AQP基因家族分类标准，将59个李AQPs划分为5个亚家族：TIPs（15个）、PIPs（17个）、NIPs（18个）、SIPs（5个）与XIPs（4个）。系统发育分析表明TIPs、PIPs与NIPs占李AQP成员的绝大多数，提示李AQP家族具有较高遗传多样性；XIPs与SIPs属同一分支但呈明显间隔分布；XIP亚家族包含4个李XIP成员（Prunus salicina：SYPsXIP1;1、SYPsXIP1;2、WSPsXIP1;1与WSPsXIP1;2）与6个番茄XIP成员，番茄XIP成员在树中形成相对独立的分支，而4个李XIP成员分布于同一主要分支内。从物种关系看，两个李品种的AQP家族成员聚为一类。

3.3 李AQP家族成员的染色体定位：全基因组注释分析表明AQP家族成员在不同品种染色体上分布不均。'三华李'SYPsAQPs成员分布于8条染色体（Chr1–8），其中Chr2含7个成员（25%），而Chr4、Chr5、Chr6与Chr7仅含1–3个成员，表现出明显的染色体偏好性。'五月脆'WSPsAQPs成员亦分布于8条染色体（Chr1–8），但较'三华李'分布更均衡：除Chr4与Chr6仅含1–2个成员外，其余染色体均至少含3个成员。

3.4 李AQP家族成员种内与种间共线性：种内共线性分析在'三华李'基因组中鉴定到5对SYPsAQPs共线基因，包括SYPsTIP4;1/SYPsTIP2;1、SYPsPIP1;3/SYPsPIP1;2与SYPsPIP2;5/SYPsPIP2;4；在'五月脆'中鉴定到6对WSPsAQPs共线基因：WSPsTIP4;1/WSPsTIP2;1、WSPsPIP2;3/WSPsPIP2;4、WSPsTIP1;1/WSPsTIP1;3、WSPsPIP2;3/WSPsPIP2;5、WSPsPIP2;4/WSPsPIP2;5与WSPsPIP1;3/WSPsPIP1;4。种间共线性分析显示'三华李'与'五月脆'之间存在36对共线基因，同源保守性最高；与拟南芥有27对共线基因对，与番茄有29对。

3.5 李AQP家族成员的保守结构域与基因结构：保守基序分析鉴定出10类基序，Motif1、Motif6、Motif3、Motif2与Motif5出现频率最高且通常有序排列，前两者偏向5′端、后两者偏向3′端，表现出保守特征。蛋白保守结构域预测显示全部PsAQP成员均含MIP结构域（PLN00026、PLN00027与GlpF均属MIP超家族）。基因结构分析表明'三华李'SYPsAQPs成员外显子数为2–7个，36%的成员含6个外显子；'五月脆'中除WSPsNIP1;2、WSPsNIP6;1（7个外显子）与WSPsPIP1;1（2个外显子）外，其余成员含3–6个外显子。AQP家族成员在两个李品种中保持相对稳定的外显子数目。

3.6 李AQP家族成员的启动子顺式作用元件：启动子顺式作用元件分析显示李AQP家族成员启动子区显著富集多种响应元件，其中光响应元件最多（720个），其次为植物激素响应元件（519个），生长发育相关元件最少（135个）。两个李品种共有的核心响应元件包括：光响应元件（SYPsAQPs 331个、WSPsAQPs 389个），以WSPsPIP2;5所含G-Box元件最多（16个）；ABA响应元件（SYPsAQPs 97个、WSPsAQPs 98个），以WSPsPIP2;5所含ABRE元件最多（14个）；MeJA响应元件（SYPsAQPs 60个、WSPsAQPs 96个）；赤霉素响应元件（SYPsAQPs 27个、WSPsAQPs 26个）；生长发育相关元件（SYPsAQPs 68个、WSPsAQPs 67个）。'五月脆'生物/非生物胁迫响应元件数（150个）远高于'三华李'（132个），主要源于厌氧诱导响应元件ARE的差异。总体上WSPsAQPs启动子区顺式作用元件数高于SYPsAQPs，提示其AQP基因可能具有更复杂的调控网络。此外，WSPsNIP7;1、SYPsNIP7;1、SYPsPIP1;2、WSPsXIP1;1与SYPsXIP1;1含种子特异性调控元件，提示李AQP基因家族特定成员可能参与调控种子发育。

3.7 李AQPs互作蛋白预测：以拟南芥为参考物种，基于STRING数据库预测蛋白–蛋白互作（protein–protein interaction，PPI）网络（该网络为基于拟南芥同源基因推断的假定关联）。预测网络提示SIP1-2与NIP2可能为连通度最高的核心节点，预测其彼此关联并与来自不同家族的多个蛋白（包括TIPA、PIP1、NAC091、PAT24与BOR4）相互作用；另一潜在核心节点WSPsSIP1;2预测与SIP1-2、NIP2及PIP、TIP家族成员关联；非AQP蛋白BOR4预测主要与NIP家族（WSPsNIP5;2、NIP2、WSPsNIP2;1）及ACR3互作。上述计算机预测为理解AQPs在李中的潜在调控作用提供了初步框架，尚待进一步实验验证。

3.8 李AQP家族成员响应裂果的表达模式：基于系统发育树与种内共线性分析，选取PIP与TIP亚家族的4个成员（PIP：SYPsPIP1;2、SYPsPIP1;3；TIP：SYPsTIP4;1、SYPsTIP2;1），分析其在WYC（'五月脆'）与SHL（'三华'）果实裂果关键期不同组织中的表达模式。结果显示，在SHL果皮与果肉组织中，4个AQP基因在裂果过程中均显著下调；而在WYC中，尽管果皮AQPs下调，但SYPsTIP4;1与SYPsTIP2;1在裂果果肉中异常升高。

**讨论与结论总结**：AQPs作为介导快速跨膜水分运输的关键膜蛋白，在植物组织水分平衡、细胞扩张与胁迫响应中发挥核心作用。随着高通量测序技术发展及李属物种高质量参考基因组的相继发布，为本研究系统挖掘李AQP家族提供了数据基础。本研究首次对P. salicina AQP基因家族进行全基因组鉴定，在'三华李'与'五月脆'中分别鉴定到28个与31个成员，数量差异主要源于TIP家族成员的不同，推测与两个品种基因组组装质量与大小（分别为282.38 Mb与318.6 Mb）差异有关。与其他物种比较显示李AQP家族规模存在物种特异性变异，但研究人员指出跨物种基因家族大小的直接比较应谨慎解读，因为报道数目可显著受基因组组装完整性、注释质量及各研究所用鉴定标准（如BLAST E值、HMM阈值）差异的影响；在此前提下，AQP数目的变异可能反映不同物种全基因组复制（whole-genome duplication，WGD）历史及随后的基因保留、丢失与亚功能化差异。蔷薇科内李AQP基因数高于樱桃（25个）与苹果（初步报道为15个），与同属核果类的桃（28个）相当，这些初步观察提示核果类果树可能维持相对保守的AQP家族规模，但尚不能确证特定的适应性进化；与其他果树类群相比，李AQP基因数低于甜橙（39个）与龙眼（35个），而与葡萄（28个）相近。保守基序分析显示Motif1与Motif6广泛分布于多数亚家族但在SIPs中缺失，而Motif4与Motif9仅特异存在于PIPs亚家族，表明各AQP亚家族既具核心通用保守序列，又具亚家族特异性基序结构，可能对应不同的水通道调控功能。启动子顺式作用元件分析显示李AQP家族成员启动子区富集光响应与植物激素响应元件，以ABA与MeJA响应元件最丰富；ABA与MeJA在种子休眠、萌发、器官衰老与非生物胁迫响应中发挥关键调控作用，提示李AQP基因可能通过整合激素信号途径参与胁迫响应，为进一步深入分析其转录调控网络提供了重要线索。果实裂果响应是AQP生理功能研究的重要方向：本研究发现AQPs在响应裂果时表现出较强的"组织特异性"与"品种特异性"；果皮是响应裂果胁迫的主要部位，两个品种裂果果皮中AQP基因均显著下调，作为果实完整性的第一道物理屏障，果皮中AQP转录本的显著下调提示转录水平上水分运输能力可能下降，该转录响应可能反映减少过量水分流入的适应性策略，此种下调可能是与细胞膨压调节改变相关的转录组特征，但这些转录水平变化是否直接导致果皮弹性丧失及最终裂果表型，尚需蛋白水平与功能验证；两个品种裂果响应模式存在显著差异，SHL中所有检测AQP基因在裂果过程中一致下调，可能反映对胁迫的整体转录响应，而WYC中尽管果皮AQPs下调，果肉中液泡膜水通道蛋白（TIPs，如SYPsTIP2;1）转录水平异常升高，此种品种特异性转录模式提示不同李品种在裂果胁迫下可能采用不同调控策略，但亦不能排除这些表达差异是组织损伤或采样时成熟阶段差异的次生效应。此外，PIPs与TIPs亚家族在裂果调控中似表现出不同功能分工：PIPs主要介导质膜水分运输，其在果皮中的急剧下降表明正常水分稳态受到破坏，对果皮细胞生理活动高度不利；TIPs表达模式最为复杂，除在果皮中一致下调外，其在果肉中的变化高度依赖品种，尤其WYC果肉中TIPs的异常上调提示液泡代谢与水分调节在易裂品种病理过程中发挥核心作用。上述结果与其他物种报道既有相似性又有互补性：Yu等人在易裂葡萄品种'香妃'中使用AQP抑制剂（纳米银）与激活剂（毛喉素），证明抑制AQP可降低吸水与裂果、激活则促进裂果，且过表达VvPIP1;1显著提高果实含水量与裂果率，证实PIPs在裂果中的关键作用；Alvaro等人发现施用钙、硼、锌等矿质元素可缓解西瓜裂果，裂果组织中CmNIP2;2与CmNIP5;1显著上调，提示NIPs可能参与裂果防御；在甜樱桃中，Chen等人鉴定到25个AQP基因并发现PaPIP1;2、PaPIP1;4与PaTIP1;1在果肉中表达高于果皮并随果实成熟而下降，Breia等人进一步证实PaPIP1;4为水与过氧化氢的双重转运蛋白，采前施用CaCl₂可上调其表达从而抑制裂果。结合本研究结果可推断，AQPs在裂果中的作用既涉及跨物种保守机制（通过质膜/液泡通道调节水势），又涉及受品种特异性、组织部位与激素信号调控的复杂互作，该精细调控网络尚待通过遗传转化与功能验证深入研究。

**研究结论**：基于'三华李'与'五月脆'基因组数据，本研究系统鉴定到李28个与31个AQP基因家族成员，家族规模与桃和葡萄相当而小于甜橙与龙眼，反映核果类特定的进化特征。启动子顺式作用元件分析显示ABA与MeJA响应元件显著富集，提示其可能通过激素信号途径参与胁迫响应。基因表达分析表明AQP家族成员在裂果过程中表现出品种特异性与组织特异性表达模式，果皮中观察到显著转录变化；果皮AQP转录本的显著下调提示其在转录水平上对裂果胁迫具有潜在调控作用，但仍需进一步功能验证以确立因果关系并确认潜在机制。本研究为进一步解析李AQP基因家族的转录调控机制及其在果实发育与裂果响应中的功能分化提供了重要理论基础。