## 一、专业标题 决明与钝叶决明（Senna tora与S. obtusifolia）的物种界定：叶绿体基因组与45S nrDNA序列的系统发育证据及InDel分子标记开发

《Genes》：qBS7 Confers Tobacco Resistance to Phytophthora nicotianae Through Temporal Coordination of Growth-Defense Balance and Metabolic Reprogramming

　　

## 三、摘要翻译

背景/目的：决明（Senna tora）与钝叶决明（Senna obtusifolia）为亲缘关系密切的草本植物物种，形态高度相似，是重要的草药来源。这两个物种长期存在分类学上的模糊性。本研究旨在利用叶绿体基因组序列和45S核糖体DNA（nrDNA）序列阐明其系统发育关系。方法：研究人员组装并分析了三个决明属种质（K276760、IT104602和K276758）的完整叶绿体基因组和45S nrDNA序列，并将这些数据集与已报道的决明属物种数据一起用于系统发育分析。随后进行比对分析，以鉴定决明与钝叶决明之间具有信息量的多态性。结果：K276760和IT104602的叶绿体基因组长度相同（162,218 bp），而K276758基因组略大（162,347 bp）。三个叶绿体基因组均呈现被子植物叶绿体基因组典型的四分体结构，并含有112个独特基因。三个种质的45S nrDNA序列长度均为5852 bp，由18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2和26S rRNA组成。基于叶绿体基因组和45S nrDNA序列的系统发育分析均将决明与钝叶决明解析为相互独立且支持度良好的分支。K276760和IT104602归入钝叶决明分支，而K276758则与决明表现出更强的亲缘性。研究人员鉴定出单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失（InDel）多态性，并开发了三个候选InDel标记用于区分决明与钝叶决明。结论：叶绿体基因组与45S nrDNA系统发育结果相互一致，为决明与钝叶决明之间的物种水平差异提供了强有力的分子证据。本研究开发的序列数据集和候选InDel标记将有助于物种鉴定以及决明属未来的分类学与进化研究。

## 四、论文解读

### 研究背景与问题

决明属（Senna）隶属豆科（Fabaceae）云实亚科（Caesalpinioideae），全球约350种，主要分布于非洲、亚洲、欧洲和拉丁美洲的热带与亚热带地区。许多决明属物种在民间医学中用于治疗微生物感染、癌症、淋病、糖尿病和疟疾等疾病，其叶、根、皮、花和种子均可入药。然而，该属分类学十分复杂：许多物种在生长习性、叶片特征和花部特征等性状上表现出广泛的形态相似性和变异，仅凭形态学进行物种鉴定常常十分困难。

决明与钝叶决明是这一问题最典型的代表。二者的种子因形态相似而在阿育吠陀和中国传统医学中被交替使用，尽管植物化学分析已揭示其种子化学成分谱存在差异。历史上，这两个类群曾被分别处理为同一物种、同一物种下的种下分类单元或两个独立物种，其依据均为形态学证据或植物化学成分。从进化角度看，生物地理学证据提示决明可能由钝叶决明或类似钝叶决明的祖先衍生而来。以往基于随机扩增多态性DNA（RAPD）标记和种子相关分子标记的研究虽已显示二者存在遗传分化，但RAPD标记分辨率较低、重复性有限，且难以提供足够系统发育信息，因此二者的分类学关系仍未解决，高通量测序尚未被用于对其分类关系进行深入分析。

叶绿体基因组结构稳定、母系遗传、突变率低，具典型四分体结构（两个反向重复区IR、一个大单拷贝区LSC和一个小单拷贝区SSC），适合被子植物进化分析；45S nrDNA则因双亲遗传、快速协同进化和同时含有保守区（18S、5.8S、26S）与快速进化区（内转录间隔区ITS）而提供互补的系统发育信息。基于此，研究人员利用质体基因组和45S nrDNA序列数据集，结合分子标记与形态学数据，旨在澄清决明与钝叶决明的遗传关系与物种界限。

### 主要技术方法

研究人员对采自美国农业部农业研究局（USDA-ARS）并通过韩国国立农业生物多样性中心（RDA）获得的决明属种质K276760、K276758和IT104602进行基因组DNA提取，利用Illumina NovaSeq 6000平台进行双末端测序；决明（cv. Myeongyun）全基因组测序数据取自NCBI的SRA数据库（SRX7825674）。随后利用CLC Assembly Cell进行reads修剪与从头组装，经NUCmer和BLASTN鉴定叶绿体来源contig，通过reads回贴补洞获得完整叶绿体基因组，并以GeSeq进行基因预测、BLAST和Artemis人工校正、CPGView绘制环形图；45S nrDNA以已报道序列（MN244678.1）为参照组装并注释。系统发育分析采用MAFFT比对、MEGA11以最大似然法（ML，GTR模型+离散Gamma分布）和邻接法（NJ，最大复合似然法）建树，bootstrap 1000次重复。序列变异经msa2vcf转换为VCF后分类为SNP和InDel，并基于InDel侧翼序列设计PCR引物。形态学性状以ImageJ 1.52a定量，采用双尾Welch t检验（p ≤ 0.05）。

### 研究结果

**叶绿体基因组与45S nrDNA的特征。** 高通量测序分别产生7.13 Gb、5.53 Gb和5.14 Gb数据。K276760与IT104602叶绿体基因组均为162,218 bp，K276758略大（162,347 bp），GC含量35.98%–36.0%。每个基因组含112个独特基因（78个蛋白编码基因、30个tRNA基因、4个rRNA基因），17个基因在IR区重复，18个基因含内含子（其中petB、petD、atpF、ndhA、ndhB、rpl16、rpl2、rps12、rps16、rpoC1及6个tRNA基因各含1个内含子，ycf3和clpP含2个内含子）。三个种质的45S nrDNA均为5852 bp，由18S rRNA（1808 bp）、ITS1（233 bp）、5.8S rRNA（164 bp）、ITS2（237 bp）和26S rRNA（3410 bp）组成，GC含量约55.0%，长度、组织与GC含量高度相似。

**决明与钝叶决明种质内的序列变异。** 对7个叶绿体基因组的比较共鉴定100个SNP和58个InDel，其中63个SNP和49个InDel位于基因间区；基因内SNP分布于17个基因（ycf1最多，9个；其次rpoC2，4个），基因内InDel仅9个，位于atpF、clpP、rpoC1、rps16、ycf1和ycf4。成对比较显示，K276760/IT104602与其他5个基因组相差84–89个SNP和50–52个InDel，而K276758与已发表决明种质仅差24个SNP和18个InDel；K276760与IT104602几乎相同（仅1个SNP差异）。值得注意的是，曾报道为钝叶决明的MK817504.2其叶绿体基因组与决明种质高度相似。45S nrDNA分析共鉴定132个SNP和80个InDel，多数SNP位于rRNA编码区（18S 18个、5.8S 4个、26S 74个），ITS1和ITS2分别含15和21个SNP；InDel多位于ITS1（27个）和ITS2（20个）。外群M. bimucronata变异最大（57个SNP、30个InDel）；K276758与决明MN244678.1仅差1个SNP和2个InDel，而K276760和IT104602各差5个SNP和5个InDel。该结果与叶绿体数据分组一致，独立地将K276758置于更接近决明的位置。

**IR收缩与扩张。** IR区长26,792 bp（IT104602、K276760）或26,791 bp（其余5个），SC/IR交界处基因组成与排列保守（rps19、rpl2、ycf1、ndhF、trnH、psbA）。JLB含rps19和rpl2，JSB除两个种质外均含ndhF和ycf1假基因；ycf1跨越JSA，但IT104602和K276760在SSC区的ycf1片段略短（4093 bp vs 4111 bp），提示该交界处存在边界位移；LSC和SSC区在二者中收缩，可能与其较小的基因组相关。

**质体与45S nrDNA系统发育支持物种界定。** 基于16个叶绿体基因组的分析将决明属分为5个主要谱系，决明与钝叶决明构成第一分支，其下再分三个亚分支：IT104602与K276760聚为一支，K276758单独成支，位于已报道决明种质与钝叶决明之间。基于45S nrDNA的分析将决明属分为3个分支，IT104602与K276760聚为一亚支，K276758与决明（MN244678.1）聚为另一亚支。ML与NJ树拓扑完全一致，两种数据集一致鉴定IT104602和K276760为钝叶决明。

**候选InDel标记用于物种鉴别。** 基于叶绿体基因组InDel设计的三对引物（InDel_35、InDel_45、InDel_51，分别靶向29 bp、18 bp和24 bp InDel）在决明cv. Myeongyun、K276758、K276760和IT104602四个种质中均产生预期大小差异的扩增产物，显示其快速鉴定决明属种质的潜力；但作者指出尚需在遗传多样性更广的种质中验证。此外，MK817504.2在三个候选标记位点上的多态性模式均与决明种质一致。

**Myeongyun与IT104602的形态差异。** 二者在生长习性、分枝模式、荚果形态和种子特征上表现出一致差异：Myeongyun株型更开展、基部主枝更多、分枝角更大，荚果弯曲且向下，而IT104602株型更紧凑、基部枝更少、分枝角更窄，荚果直且向上；百粒重分别为2.37 g和3.34 g。株高、开花天数及种子和荚果相关性状的定量测定亦显示显著差异，与分子证据共同为二者鉴定提供依据。

### 讨论与结论

讨论指出，新组装叶绿体基因组大小（162,218–162,347 bp）与已报道决明属物种（如S. tora 162,426 bp、S. obtusifolia 159,176 bp等）相近，基因组成与类型亦具可比性。变异分析显示大部分变异集中于基因间区（63%的SNP、84%的InDel），符合非编码区进化更快的规律，同时编码区变异较低反映叶绿体基因组保守、进化缓慢；新鉴定变异中74%的SNP和67.2%的InDel为IT104602和K276760特有，说明二者遗传高度相似。45S nrDNA在早期分化物种（如M. bimucronata）中分化较高，向近期分化物种逐渐降低，反映突变累积与协同进化的共同作用。IR/SC边界仅有微小差异，与被子植物质体基因组总体稳定的特点一致；IT104602和K276760中较短的ycf1片段及LSC、SSC收缩可能代表谱系特异性进化事件。尽管K276760与K276758均被描述为钝叶决明，分子分析表明二者为遗传上不同的谱系；K276760与IT104602同决明的清晰分离及其原始种质 designation 支持将该谱系鉴定为钝叶决明，研究人员正对IT104602开展全基因组测序。MK817504.2在系统树中与决明聚为一类，其分类地位值得进一步核实；K276758分类归属与分子系统位置的矛盾凸显了测序技术在解决近缘种分类问题中的价值。三种InDel标记在决明与钝叶决明种质间产生可清晰区分的片段大小差异，形态比较亦显示明显表型差异，基因组证据、分子标记与形态差异三者一致，为区分两个物种提供互补支持。作者同时承认局限：系统发育取样有限（尤其45S nrDNA数据集）、InDel标记仅在4个种质中验证、形态比较每种仅1个种质，未来需扩大取样与验证。

结论部分译文：研究人员组装并注释了三个决明属种质K276760、K276758和IT104602的完整叶绿体基因组和45S nrDNA序列，为该属未来的分类学与进化研究提供了宝贵的基因组资源。利用这些序列数据集，研究人员澄清了决明与钝叶决明的分类学关系。基于叶绿体基因组和45S nrDNA序列的系统发育分析一致地将这两个类群置于相互独立且支持度良好的分支中，表明其存在清晰的遗传分化。比较分析还鉴定出可用于区分两个物种的SNP和InDel等有用分子特征。本研究开发的候选分子标记可能为物种鉴定和决明属遗传资源的有效利用提供有价值的工具。此外，Myeongyun与IT104602的形态比较显示其在生长习性、分枝模式以及荚果和种子性状上存在明显差异。总之，研究结果提供了支持决明与钝叶决明为两个独立物种的证据。