《Genes》：Phylogenetic Assessment of Senna tora and Senna obtusifolia Using Chloroplast Genome and 45S nrDNA Sequences
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背景/目的：Senna tora与Senna obtusifolia为形态高度相似、亲缘关系密切的草本植物，是重要的草药来源，其分类地位长期存在争议。本研究旨在利用叶绿体基因组（chloroplast genome）序列与45S核糖体DNA（45S nrDNA
背景/目的：Senna tora与Senna obtusifolia为形态高度相似、亲缘关系密切的草本植物，是重要的草药来源，其分类地位长期存在争议。本研究旨在利用叶绿体基因组（chloroplast genome）序列与45S核糖体DNA（45S nrDNA）序列阐明二者的系统发育关系。方法：对三份Senna种质（K276760、IT104602和K276758）的完整叶绿体基因组与45S nrDNA序列进行组装与分析，并与已报道的Senna物种数据共同用于系统发育分析；进而开展比较分析，鉴定S. tora与S. obtusifolia之间具有信息价值的 polymorphisms（多态性）。结果：K276760与IT104602的叶绿体基因组长度一致（162,218 bp），K276758略大（162,347 bp）。三个叶绿体基因组均呈现被子植物叶绿体基因组典型四分体结构，并含112个unique genes（特有基因）。三份种质的45S nrDNA序列长度均为5852 bp，由18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2和26S rRNA组成。基于叶绿体基因组与45S nrDNA序列的系统发育分析均将S. tora与S. obtusifolia解析为分离且支持度良好的clades（分支）。K276760与IT104602归于S. obtusifolia分支，而K276758与S. tora亲缘更近。研究鉴定出单核苷酸多态性（SNPs）及插入/缺失（InDel）多态性，并开发了3个候选InDel标记用于区分S. tora与S. obtusifolia。结论：叶绿体基因组与45S nrDNA系统发育结果一致，为S. tora与S. obtusifolia的物种级差异提供了有力的分子证据；本研究所获序列数据集与候选InDel标记可用于物种鉴定及Senna属未来分类学与进化研究。
**研究背景与问题** Senna属（豆科Fabaceae，云实亚科Caesalpinioideae）约350种，广布于非洲、亚洲、欧洲和拉美热带与亚热带地区，多种为民间药用植物，其叶、根、皮、花、种子提取物用于治疗微生物感染、肿瘤、淋病、糖尿病和疟疾等。该属分类复杂，许多物种在生长习性、叶部和花部特征上形态相似且变异大，物种鉴定困难。S. tora与S. obtusifolia因种子形态相似而在阿育吠陀和中医中被互换使用，但植物化学分析显示二者种子化学成分不同。历史上二者曾被处理为同一物种、同一种下的种下分类单元或两个独立物种，依据均为形态或植物化学证据；生物地理学证据提示S. tora可能源自S. obtusifolia或其类似祖先。分子工具虽已用于物种鉴定，但既往基于随机扩增多态DNA（RAPD）标记和种子相关分子标记的研究分辨率低、重复性有限、系统发育信息不足，且尚未见高通量测序用于深入解析二者分类关系，故其分类关系仍未解决。
**研究内容与结论** 研究人员对Senna种质K276760、K276758、IT104602的完整叶绿体基因组和45S nrDNA进行测序、组装和注释，并与公共数据比较，鉴定单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失（InDel）变异，开发3个候选InDel标记并辅以形态性状比较，整合质体基因组、45S nrDNA、分子标记和形态学数据，得出S. tora与S. obtusifolia为两个独立物种的支持性证据。其意义在于为Senna属物种鉴定、分类学和进化研究提供基因组资源与候选标记。
**主要技术方法** 材料来自USDA-ARS（经韩国农村振兴厅国立农业生物多样性中心获得）的K276760（DLEG 990007）、K276758（DLEG 910091）及直接得自该中心的IT104602；S. tora cv. Myeongyun全基因组测序数据取自NCBI的SRA（SRX7825674）。采用Illumina NovaSeq 6000平台进行双端测序，CLC Assembly Cell进行reads质控与de novo组装，以MUMmer的NUCmer和BLASTN鉴定叶绿体来源contig，经read mapping补洞和人工校正获得完整叶绿体基因组；GeSeq预测基因并结合Artemis人工校正，CPGView绘制环形图；45S nrDNA以已报道序列（MN244678.1）为参照组装与注释。系统发育分析用MAFFT ver. 7比对，MEGA11以最大似然法（ML，GTR模型+离散Gamma分布）和邻接法（NJ，最大复合似然法）建树，bootstrap 1000次重复。变异检测将比对结果经JVarkit的msa2vcf转为VCF格式分类SNP和InDel并设计引物。形态学评估测量株高、开花天数（各5个生物学重复）及100粒种子和10个荚的性状（ImageJ 1.52a），以双侧Welch t检验比较（p ≤ 0.05）。
**研究结果**
3.1 叶绿体基因组与45S nrDNA特征 三份种质分别获得7.13 Gb、5.53 Gb、5.14 Gb数据。K276760与IT104602叶绿体基因组均为162,218 bp，K276758为162,347 bp，GC含量35.98%–36.0%；各含112个特有基因（78个蛋白编码基因、30个tRNA基因、4个rRNA基因），17个基因在反向重复（IR）区重复，18个基因含内含子。45S nrDNA均为5852 bp，由18S rRNA（1808 bp）、ITS1（233 bp）、5.8S rRNA（164 bp）、ITS2（237 bp）和26S rRNA（3410 bp）组成，GC含量约55.0%。
3.2 S. tora与S. obtusifolia种质内的序列变异 对7份叶绿体基因组比较鉴定出100个SNPs和58个InDels，其中63个SNPs和49个InDels位于基因间区；基因内SNPs分布于17个基因，ycf1最多（9个），其次rpoC2（4个）；基因内InDels位于6个基因。K276760与IT104602叶绿体基因组仅差1个SNP，与其余5份相差84–89个SNPs和50–52个InDels；K276758与已发表S. tora仅差24个SNPs和18个InDels。MK817504.2虽曾被描述为S. obtusifolia，但其叶绿体基因组与S. tora高度相似。45S nrDNA分析鉴定出132个SNPs和80个InDels，SNPs多位于rRNA编码区（26S rRNA中74个），InDels多位于ITS1（27个）和ITS2（20个）；K276758与S. tora MN244678.1仅差1个SNP和2个InDels，K276760与IT104602各差5个SNPs和5个InDels，重现了叶绿体数据的类群划分。
3.3 IR收缩与扩张 IR区长26,792 bp（IT104602、K276760）或26,791 bp（其余5份），SC/IR连接处基因组成与排列保守（rps19、rpl2、ycf1、ndhF、trnH、psbA）；IT104602与K276760在SSC区的ycf1片段较短（4093 bp vs 4111 bp），LSC和SSC区收缩，可能与其较小的基因组相关。
3.4 质体基因组与45S nrDNA系统发育支持物种界定 叶绿体基因组系统发育将Senna分为5个主要谱系，第一个分支含S. tora与S. obtusifolia并分为3个亚分支，IT104602与K276760聚在一起，K276758单独成亚分支位于二者与已报道S. tora之间；MK817504.2与S. tora聚为一类，提示其分类命名需进一步核实。45S nrDNA系统发育结果一致：IT104602与K276760同亚分支，K276758与S. tora（MN244678.1）聚类。ML与NJ分析拓扑结构完全一致，表明IT104602与K276760为S. obtusifolia。
3.5 候选InDel标记用于物种鉴别 基于叶绿体基因组InDels设计3个标记（InDel_35、InDel_45、InDel_51，分别针对29 bp、18 bp、24 bp InDel），在S. tora cv. Myeongyun、K276758、K276760和IT104602四份种质中均产生预期的大小差异扩增产物，显示其快速鉴定潜力，但尚需更广泛种质验证。MK817504.2在三个标记位点与S. tora种质具有相同多态性模式，支持其与S. tora的分子关联。
3.6 Myeongyun与IT104602的形态差异 二者在生长习性、分枝模式、荚形态和种子特征上差异明显：Myeongyun植株披散、基部主枝多、分枝角大、荚弯曲下垂，IT104602较紧凑、基部枝少、分枝角小、荚直立向上；百粒重分别为2.37 g和3.34 g，株高、开花天数及种子和荚相关性状差异显著。
**讨论与结论** 讨论指出，新组装叶绿体基因组大小与已报道Senna物种相近，具典型四分体结构，基因组成与既往报道相当；变异多集中于基因间区，符合非编码区进化较快、编码区保守的特点；74%的SNPs和67.2%的InDels为IT104602与K276760特有，显示二者高度遗传相似。45S nrDNA中早期分化种（M. bimucronata）序列分化较高，向近期分化种递减，反映突变积累与协同进化。IR/SC边界仅见微小差异，ycf1片段缩短提示谱系特异性进化事件。尽管K276760和K276758均被标注为S. obtusifolia，分子分析显示其属遗传上不同的谱系；K276760与IT104602同属一支，结合其原始种质标注支持该谱系为S. obtusifolia。MK817504.2的分类归属与系统发育位置不符，其身份需进一步核实，K276758的分类归属与分子位置不一致凸显测序技术在近缘种分类中的价值。作者同时指出局限性：系统发育取样有限（尤其45S nrDNA）、InDel标记仅在4份种质中验证、形态比较每种仅1份种质，需更广泛取样验证。结论部分译述为：研究人员组装并注释了三份Senna种质K276760、K276758和IT104602的完整叶绿体基因组和45S nrDNA序列，为该属未来分类学和进化研究提供了宝贵的基因组资源；利用这些序列数据集阐明了S. tora与S. obtusifolia的分类关系，基于叶绿体基因组和45S nrDNA的系统发育分析一致地将二者置于分离且支持度高的分支中，表明其存在清晰的遗传分化；比较分析还鉴定出可用于区分二者的SNPs和InDels；所开发的候选分子标记可为物种鉴定和Senna遗传资源的有效利用提供有价值的工具；Myeongyun与IT104602的形态比较显示生长习性、分枝模式及荚和种子性状的明显差异。总体而言，研究结果为S. tora与S. obtusifolia为两个独立物种提供了支持性证据。
