《Heliyon》：Spexin (SPX), enkurin, reelin, and DARS2 as candidate tissue biomarkers to distinguish benign and malignant gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms and differentiate NET grades
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本研究旨在探讨Spexin（SPX）、Enkurin、Reelin与DARS2作为候选组织生物标志物在区分胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP NENs）良恶性及分化神经内分泌肿瘤（NET）分级中的价值。研究人员对120例GEP NENs病例（包括NET G1、NET
本研究旨在探讨Spexin（SPX）、Enkurin、Reelin与DARS2作为候选组织生物标志物在区分胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP NENs）良恶性及分化神经内分泌肿瘤（NET）分级中的价值。研究人员对120例GEP NENs病例（包括NET G1、NET G2、NET G3及神经内分泌癌（NEC）各30例）进行了回顾性评估。通过免疫组织化学染色检测SPX、DARS2、Reelin、Enkurin及INSM1的表达，并采用组织学评分进行半定量分析。结果显示，INSM1在所有分组中均呈高表达，但无法区分肿瘤分级或良恶性。而SPX与DARS2的表达水平随肿瘤分级升高而递增，在NEC中达到最高；Reelin与Enkurin则呈现相反趋势，其表达随分级升高而递减，在NET G1中最高。四种标志物在不同分级间的差异均具有统计学显著性（p = 0.001）。研究表明，SPX、DARS2、Reelin与Enkurin可有效区分GEP NET的不同分级及NET与NEC，有望作为INSM1的补充标志物，提升病理诊断的准确性，并为治疗策略的制定提供依据。
研究背景与问题
神经内分泌肿瘤（NENs）是一类形态学和临床异质性显著的肿瘤，起源于分布于多器官系统的神经内分泌细胞。组织学上，NENs分为高分化神经内分泌肿瘤（NET）和低分化神经内分泌癌（NEC），分级主要依据核分裂象活性和Ki-67指数。近年来，分类体系的完善和诊断方法的改进使报告发病率上升，并促使学界更加关注与分级相关的生物学行为，尤其是NET G3与NEC的鉴别。尽管两者均为高级别实体，但新兴临床数据表明其生物学特性、治疗反应及预后存在差异，因此在诊断时需进行细致的形态学、免疫组化乃至分子层面的区分。然而，在常规实践中，常用的免疫组化标志物如嗜铬粒蛋白A（CgA）和突触素（Synaptophysin）虽可用于确立神经内分泌谱系，但在分级方面表现不佳：CgA易受质子泵抑制剂、肾功能障碍等因素干扰；而INSM1虽为敏感且特异的核转录因子，能确认神经内分泌身份，却无法分层肿瘤分级或恶性程度，其在各级NET及多数NEC中均保持表达。因此，病理医生在小活检标本中鉴别NET G3与NEC时常面临挑战，尤其是在结构有限、细胞学细节不显著且增殖指数可能重叠的情况下。基于此，迫切需要能够编码侵袭性信息的组织生物标志物，以补充现有免疫组化组合。本研究探索了Spexin（SPX）、Enkurin、Reelin和DARS2作为候选标志物的潜力，这些分子与致癌通路存在合理关联：SPX是一种参与代谢和炎症调控的神经肽，与NF-κB及PPAR-γ/AMPK信号通路有关；DARS2是线粒体天冬氨酰-tRNA合成酶，其过表达与多种实体瘤的细胞周期进展和抗凋亡相关；Reelin经典地参与神经元迁移和皮层分层，现已在癌症生物学中被发现具有依赖情境的迁移和侵袭作用，可能与TGF-β通路交叉；Enkurin是与钙通透通道相关的衔接蛋白，在某些癌种中通过PI3K/AKT和MAPK/ERK轴发挥抑癌作用。研究人员假设，由SPX、Enkurin、Reelin和DARS2组成的四标志物组织面板将呈现与分级相关的表达模式——SPX/DARS2随组织学侵袭性增强而上升，Reelin/Enkurin则下降——从而在鉴别NET分级及区分NET与NEC方面补充INSM1的作用。
研究方法
本研究经F?rat大学地方伦理委员会批准，为回顾性设计，共纳入120例病例：NET G1（n=30）、NET G2（n=30）、NET G3（n=30）和NEC（n=30）。纳入标准包括组织学确诊的GEP NENs、活检前未接受新辅助化疗或放疗、完整的临床/人口学数据。排除标准为合并可能改变标志物表达的恶性肿瘤、质量差或坏死/不足的活检、可能影响表达的严重全身性疾病及数据不全者。免疫组化染色在组织微阵列（TMA）的3μm切片上进行，使用针对Enkurin、Reelin、Spexin和DARS2的一抗，并由两名盲法阅片者独立评估染色强度，计算组织学评分（histoscore = 分布×强度）。统计分析采用IBM SPSS Statistics v22.0，连续变量正态性检验后，非正态分布变量使用Mann-Whitney U检验（两组）和Kruskal-Wallis检验（三组及以上），显著性水平设为α=0.05。
研究结果
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一般特征：各组间性别无显著差异（p=0.765），但年龄差异显著（p=0.012）。肿瘤更常见于男性，NENs多在50岁后诊断，且肿瘤分级随年龄增长而升高，NEC更多见于70岁后。各组病变分布无显著差异（p=0.410）。
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免疫组化染色评估：INSM1、Reelin、SPX、Enkurin和DARS2在GEP NENs中均有表达。其中，DARS2、SPX和Reelin呈胞浆和胞膜染色，而INSM1和Enkurin呈核染色。所有标志物的组间表达差异均具有统计学显著性（p=0.001）。
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INSM1表达：INSM1在所有分组中表达最高，但其在NET G1、NET G2和NET G3之间的表达无显著差异（p=0.668），表明其不能区分肿瘤分级。
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Reelin与Enkurin表达：Reelin和Enkurin在NET G1组中表达最高，随后在NET G2和NET G3中逐渐降低，差异具有统计学意义（p=0.001）。其在NEC中表达最低。这表明Reelin和Enkurin随肿瘤分级升高而表达下降。
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SPX与DARS2表达：SPX和DARS2在NET G3组中表达最高，从NET G3到NET G1表达逐渐降低，差异具有统计学意义（p=0.001）。其在NEC中表达最高。这表明SPX和DARS2随肿瘤分级升高而表达上升。
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综合比较：SPX和DARS2的表达水平高于Reelin和Enkurin，差异显著（p=0.001），但SPX与DARS2之间、Reelin与Enkurin之间无显著差异（p>0.05）。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究首次在GEP NETs和NECs中研究了Reelin、Spexin、Enkurin和DARS2的表达及其与INSM1的关联。研究发现，INSM1虽是敏感的神经内分泌分化标志物，但无法区分良恶性或可靠地分层NET分级。相比之下，SPX/DARS2（随分级升高）和Reelin/Enkurin（随分级降低）编码了组织学侵袭性信息，在与形态学和标准面板整合时，可为鉴别NET G3与NEC增加区分价值。研究进一步讨论了这些标志物与已知致癌通路（如NF-κB、PI3K-AKT-mTOR、STAT3）的潜在联系，并分别阐述了SPX（可能通过PPAR-γ/AMPK通路发挥保护作用）、DARS2（通过ERK/c-Myc通路促进肿瘤形成）、Reelin（与TGF-β信号相关，表达下降可能促进转移）和Enkurin（通过PI3K/Akt和MAPK/ERK通路发挥抑癌作用）在NENs中的可能角色。研究结论强调，SPX、DARS2、Reelin和Enkurin在GEP NENs不同分级中展现出独特的表达模式，可作为互补性生物标志物用于肿瘤分级及区分NET与NEC。研究的局限性包括回顾性设计、缺乏Western blot验证以及未深入探究相关信号通路。最终结论总结为：本研究表明，SPX、DARS2、Reelin和Enkurin在GEP NENs各分级中呈现不同的表达模式。虽然INSM1仍是可靠的诊断标志物，但它缺乏区分肿瘤分级或恶性的能力。相比之下，SPX和DARS2随肿瘤进展而表达增加，而Reelin和Enkurin则表达减少，提示它们可作为分级和区分NET与NEC的补充生物标志物。需要进一步的大规模前瞻性研究来验证这些发现。
