**南极分离株 Sphingomonas sp. UV9 乙醇提取物作为潜在皮肤愈合剂的研究**

《Heliyon》：Ethanolic extract of the Antarctic isolate Sphingomonas sp. UV9 as a potential skin healer

　　

皮肤愈合过程对机体的生理、美学及心理健康至关重要。尽管已有多种促进愈合的治疗手段，但其有效性往往有限，凸显了对新方案的持续需求。目前，已有若干具有化妆品护肤应用潜力的南极生物分子被报道。然而，利用南极细菌促进创面闭合的研究仍较少。本研究评估了南极分离株 Sphingomonas sp. 乙醇提取物（ethanolic extract，ExUV9）作为皮肤愈合剂的潜力。采用 HaCaT 角质形成细胞系及基于柱塞的划痕模型进行的体外实验（in vitro）显示，ExUV9 表现出剂量依赖性的创面愈合活性，并可刺激细胞增殖与迁移过程。此外，研究证明暴露于所评估剂量的 ExUV9 既不会损害细胞活力，也不会增加微核（micronucleus）形成频率，同时与基础水平相比显著降低了 γH2Ax 标记。此外，ABTS 实验显示 ExUV9 具有抗氧化能力。为评估其体内（in vivo）功效，研究还采用大鼠切除创面模型评价了 ExUV9 对皮肤修复的作用。该实验表明，经 ExUV9 治疗 8 天后创面闭合得到改善。研究结果表明，ExUV9 是作为治疗性皮肤愈合剂的有前景候选物。

**研究背景与问题** 皮肤具有通过协调的创面愈合与修复过程恢复损伤后结构完整性的内在能力，该动态过程需经历止血、炎症、增殖与成熟等连续且相互重叠的阶段。当创面愈合失败时，组织可进入病理性炎症状态，导致愈合时间延长或形成瘢痕疙瘩、增生性瘢痕甚至慢性创面。随着人口老龄化及肥胖、糖尿病、血管疾病等慢性疾病增多，慢性创面患病率上升，给个体生活质量与医疗系统带来沉重负担。现有创面管理策略涵盖侵入性手术至局部治疗，其中局部治疗多采用含生物活性成分的天然产物；植物来源因含生物碱、精油、黄酮类、单宁、萜类、皂苷及酚类化合物而具抗氧化、抗炎和抗菌特性，但其临床应用受限于有害提取溶剂、生物活性回收率欠佳、生物利用度低及缺乏稳健临床试验数据。其他先进手段如富血小板血浆、生长因子、干细胞治疗及羊膜/膜类制剂中，仅 Regranex? 凝胶（活性成分贝卡普勒明，becaplermin，一种源自人血小板的重组生长因子）获美国食品药品监督管理局（FDA）批准为活性创面愈合产品，但高昂成本限制其作为一线治疗的可及性。因此，开发可负担的创面疗法仍是全球重要优先事项。细菌代谢物的生物技术应用是医学与工业研究的新兴领域，南极极端极地环境已成为有用微生物生物产品的 promising 来源；南极生物分子在皮肤科与化妆品中的应用包括 Microbacterium sp. LEMMJ01 的类胡萝卜素（光保护分子）以及源自 Pseudoalteromonas antarctica 的专利糖蛋白 Antarcticin-NF3（ANTARCTICINE?，具保湿、冷冻保护与抗皱特性）。然而，这些南极细菌在创面愈合中的生物技术应用潜力尚未被评估。本研究旨在评估南极细菌分离株作为促进创面闭合的生物分子来源的生物技术潜力。

**主要技术方法** 研究人员采用 HaCaT 角质形成细胞（spontaneously immortalized human keratinocytes）划痕闭合模型评估提取物体外促愈合活性；以刃天青（resazurin，RZ）法检测细胞活力；以 Click-iT 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）掺入法检测细胞增殖；以流式细胞术碘化丙啶（propidium iodide）染色分析细胞周期；以细胞分裂阻断微核实验（cytokinesis-block micronucleus assay）及 γH2Ax 免疫显微术评估遗传毒性；以 2,2′-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）法测定总抗氧化能力；并采用五周龄雄性 Wistar 大鼠（The Jackson Laboratory，USA）1 × 1 cm 背侧切除创面模型进行体内评价，结合苏木精-伊红染色及平滑肌肌动蛋白（SMA）、Ki67 免疫组化。研究所用 12 株南极细菌由 Marizcurrena 等（2017）分离鉴定。统计分析采用 Student's-t 检验及单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Dunnett 多重比较。

**研究结果**

**UV1–UV12 提取物在体外创面愈合模型中的生物勘探** 十二株南极分离株的 DMSO 提取物吸收光谱存在差异，UV3、UV9、UV10、UV11 及 UV12 具独特光谱特征，UV9 最大吸收在 500 nm。在 HaCaT 细胞创面闭合模型中，Pseudomonas sp. UV7、Sphingomonas sp. UV9 与 UV10 的创面闭合率分别为 93.2 ± 11.9%、124.1 ± 6.1% 和 93.6 ± 4.2%，高于 0.1% FBS 对照，被鉴定为潜在促创面闭合因子。

**Sphingomonas sp. UV9 乙醇提取物在体外创面愈合模型中的评价** ExUV9 吸收光谱与 DMSO 提取物相似，在紫外区（280 nm）与可见区（480 nm）均有最大吸收。HaCaT 创面闭合实验显示 ExUV9 以浓度依赖方式促进创面闭合，在 3.13 至 200 μg/mL 范围内闭合率为 35 ± 13% 至 220 ± 39%；未接种 TSB 培养基经相同冻干与提取流程后未引起创面闭合变化，证明所观察到的生物活性源自微生物产生的代谢物而非培养基本身。

**ExUV9 对 HaCaT 细胞活力与增殖的影响** RZ 实验显示，24 h 时 25、50、100 与 200 μg/mL ExUV9 显著提高细胞活力，分别为 124.5 ± 14.7%（p = 0.059）、134.0 ± 22.4%（p < 0.0017）、132.4 ± 20.1%（p < 0.0001）和 129.8 ± 22.6%（p = 0.0001）；48 h 时呈相同趋势，分别为 112.1 ± 5.7%（p = 0.0103）、122.7 ± 7.0%（p < 0.0001）、115.8 ± 10.3%（p = 0.0008）和 115.7 ± 6.1%（p = 0.0008），且无剂量降低细胞活力，表明该浓度范围 ExUV9 对 HaCaT 无细胞毒性。EdU 掺入实验显示，0.1% FBS 培养的 HaCaT 基础 EdU 掺入率为 14.11 ± 4.57%，显著低于 10% FBS 培养（p < 0.0001）；ExUV9 处理组 EdU 掺入随剂量增加呈上升趋势，6.25、25 与 100 μg/mL 时分别为 16.02 ± 17.16%、24.68 ± 66.50% 和 37.75 ± 96.14%，其中 100 μg/mL 组与 0.1% FBS 对照相比差异有统计学意义（p = 0.016）。流式细胞术分析显示，0.1% FBS 对照中细胞主要处于 G1 期，sub-G1、G1、S 与 G2 期比例分别为 7.66 ± 2.19%、77.07 ± 1.92%、6.27 ± 0.55% 和 8.99 ± 0.03%；ExUV9 在 6.25、25 与 100 μg/mL 时显著降低 G1 期细胞比例，分别为 71.51 ± 0.46%（p = 0.0003）、72.18 ± 1.21%（p = 0.0009）和 66.28 ± 0.63%（p < 0.0001），S 期细胞比例随 ExUV9 增加而升高，25 与 100 μg/mL 时分别达 10.15 ± 0.33% 和 14.78 ± 0.40%，与对照相比差异显著（p = 0.0255 和 p = 0.0005）；SubG1 与 G2 期细胞群体无显著增加（p > 0.05）。10% FBS 与 10 μM 顺铂（CDDP）对照表现出预期行为，前者 S 与 G2 期细胞群体显著扩增提示增殖增加，后者引起典型 S 期阻滞及 SubG1 群体增加。

**ExUV9 对 HaCaT 细胞的遗传毒性分析** 细胞分裂阻断微核实验表明，与溶剂对照相比 ExUV9 未诱导遗传毒性，微核生成频率无增加（p = 0.86），而 H₂O₂ 暴露组微核频率增加（p < 0.05）；细胞增殖指数与溶剂对照相比亦无改变（p = 0.52），而 H₂O₂ 处理导致增殖指数下降（p < 0.05）。γH2Ax 免疫荧光分析显示，ExUV9 处理 3 或 24 h 均未诱导遗传损伤，且与溶剂对照相比，ExUV9 处理组 γH2Ax 标记细胞百分比在 3 与 24 h 均显著降低（p = 0.0125 和 p = 0.0051），标记细胞比例由溶剂对照基线 26.87% 分别降至 22.52% 和 22.58%。ABTS 实验显示 ExUV9 可降低溶液中 ABTS⁺ 自由基水平，表明其具抗氧化能力，ExUV9 的 IC₅₀ 值为 235.3 ± 48.2 μg/mL，Trolox 标准品 IC₅₀ 为 7.5 ± 2.8 μg/mL。

**ExUV9 的体内创面闭合分析** 大鼠切除创面模型中，第 8 天 ExUV9 局部治疗组创面收缩率为 92.2 ± 2.2%，对照为 82.1 ± 3.5%（p = 0.0006）；第 11 天 ExUV9 组与对照组创面收缩率分别增至 99.7 ± 0.2% 与 95.4 ± 1.0%（p < 0.0001）。第 11 天皮肤创面活检组织学检查显示 ExUV9 治疗动物愈合进程略为先进，但 ExUV9 与溶剂治疗创面在肉芽组织形成、炎症或新生血管化方面于 11 天时无显著差异。SMA 定量显示 ExUV9 组肌成纤维细胞较对照组更丰富，信号分别为 8.03 ± 0.88 与 4.74 ± 0.98 AU。ExUV9 治疗动物再上皮化更先进，痂皮较不明显并出现新生毛囊；其上皮厚度较对照组更接近正常大鼠背侧皮肤，而对照组可见表皮肥大，符合愈合早期阶段。Ki67 染色显示对照创面增殖指数（37.0 ± 8.1%）高于 ExUV9 治疗创面（17.4 ± 5.1%）。

**讨论与结论** 讨论指出，细菌代谢物的生物技术应用是医学与工业研究的新兴领域，益生菌及具抗衰老活性的细菌提取物为当前应用或临床试验中的突出例子。具前景活性的分离株数量提示南极细菌所栖息的极端环境使其成为皮肤健康生物技术应用代谢物的宝贵来源；来自 Sphingomonas 与 Pseudomonas 属的色素型与非色素型提取物均促进 HaCaT 培养中的创面闭合。尽管 Pseudomonas 属常与病原体关联，但若干研究强调部分 Pseudomonas 物种能产生具抗生素特性并可增强创面愈合的天然生物表面活性剂鼠李糖脂，应进一步研究本研究中鉴定为促愈合候选的 Pseudomonas sp. UV7。两个具创面愈合活性的 Sphingomonas 代表株（UV9 与 UV10）中，UV9 因其 DMSO 提取物在全部筛选菌株中创面闭合率最高而被选为进一步研究，且其基因组已测序，为鉴定生物活性成分、研究生物合成基因及工程改造提高产量/降低成本提供基础。ExUV9 在低至 3.13 μg/mL 至高达 60 倍的剂量范围内显著加速体外创面闭合，且不损害细胞活力；与芦荟凝胶或全叶提取物在 mg/mL 浓度范围促进创面闭合相比，尽管提取物存在进化分歧及提取方法不可比性，ExUV9 相较于传统医学常用芦荟提取物的治疗潜力仍显而易见。除无细胞毒性外，微核频率分析未发现遗传损伤证据，与 Aloe arborescens 凝胶对人成纤维细胞在 100–500 μg/mL 剂量下的安全性特征类似。生理代谢过程、氧化应激及紫外线（UV）辐射等外部因素持续诱导皮肤细胞 DNA 损伤；γH2Ax 分析表明 ExUV9 降低基础遗传损伤水平，可能与其抗氧化能力相关（ABTS 实验所证实）。ExUV9 总抗氧化能力低于以清除活性氧（ROS）活性高著称的 Trolox；ROS 平衡紊乱对皮肤愈合有害，ROS 水平过低或过高均可导致慢性或受损创面，因此 ExUV9 中等程度的抗氧化特性可能为其创面愈合特性提供依据，但需注意 ExUV9 并非纯制剂，确定其组成有助于将其抗氧化潜力与其他抗氧化及促创面愈合代谢物或提取物比较。体内实验显示 ExUV9 治疗动物创面闭合更早，加速愈合可能源于 ExUV9 对创面愈合级联多个阶段的调节作用；炎症阶段 ROS 信号激活免疫浸润并控制免疫介质的程度影响后续增殖与重塑阶段，角质形成细胞响应免疫浸润分泌的细胞因子而增殖，若失调可导致上皮增生；ExUV9 治疗创面中增殖角质形成细胞（Ki67 阳性）数量较增生性对照创面减少，未来研究应探讨 ExUV9 抗氧化活性是否能够调节免疫浸润并进而调节增生。相反，在缺乏其他细胞类型时，ExUV9 可诱导 DNA 合成，从而在分离角质形成细胞中以剂量依赖方式（25–100 μg/mL）刺激细胞增殖，其特征为 S 期细胞群体增加及胸苷类似物 EdU 掺入升高；RZ 实验观察到的细胞活力剂量依赖性增加（25–200 μg/mL）也可能与细胞数量增加相关，可能源于 ExUV9 刺激 HaCaT 细胞增殖的能力，类似现象见于 Lactobacillus sp. 菌株通过协同刺激培养中角质形成细胞增殖与迁移促进创面闭合，而源自 Bacillus subtilis 的纯化化合物 Surfactin A 亦被证明促进角质形成细胞迁移；ExUV9 可能在低剂量范围（3.125 至 25 μg/mL）不表现增殖活性但较对照组增强创面闭合，提示其可能促进角质形成细胞迁移增加。其他促创面愈合提取物及分离分子调节角质形成细胞增殖与迁移的机制涉及细胞因子、MAPK、Smad、NF-κB、Hedgehog 与 RUNX 等多个不同信号通路；评估特定生物标志物将阐明 ExUV9 调节角质形成细胞增殖与迁移的精确信号通路。苏木精-伊红染色与 SMA 免疫组化结果显示 ExUV9 治疗创面中（肌）成纤维细胞丰度高于对照；成纤维细胞在炎症晚期开始迁移至创面部位，驱动新的细胞外基质沉积，促进收缩、纤维蛋白凝块分解及增殖期启动；ExUV9 治疗动物中观察到的加速创面闭合可能与治疗后第 11 天（增殖期与重塑期过渡期间）肌成纤维细胞数量增加相关，因为这些细胞主动驱动创面收缩；肌成纤维细胞功能正常对预防异常瘢痕也很重要，且 ROS 似乎与肌成纤维细胞过度活化有关；尽管本实验研究未涵盖重塑过程的最终阶段，延长实验时间将在未来研究中提供有价值的信息，特别是关于 ExUV9 抗氧化活性调节肌成纤维细胞诱导纤维化的潜力。研究局限性包括：ExUV9 中活性化合物的具体化学组成尚未确定，而这对于阐明提取物发挥愈合作用的分子靶点至关重要；需要进一步体内试验独立评估每个愈合阶段以及 ExUV9 对每种参与细胞类型的作用。尽管如此，研究发现为增强创面愈合的新型天然来源提供了有价值的信息。**结论**：南极细菌是具有组织创面愈合应用潜力的生物活性代谢物的有前景储库；具体而言，Sphingomonas sp. UV9 乙醇提取物表现出愈合剂所期望的关键治疗特性，包括促进细胞增殖与迁移以及抗氧化活性，同时无细胞毒性与遗传毒性作用。