工程化三特异性EGFR × c-MET × VEGF抗体通过多重作用机制在胃肠癌模型中展现抗肿瘤活性

《Antibodies》：Engineering a Trispecific EGFR × c-MET × VEGF Antibody with Multiple Mechanisms of Action for Antitumor Activity in Gastrointestinal Cancer Models

　　

摘要 背景： 胃肠（GI）癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，且常对单药治疗方案产生耐药。EGFR、cMET和VEGF通路的失调在这些恶性肿瘤中常同时出现，使得多靶点联合治疗成为一种有前景的策略。目的： TAVO412，一种靶向EGFR、cMET和VEGFA的三特异性抗体，通过互补的作用机制（MOA）抑制多种胃肠癌细胞系。方法/结果： TAVO412有效抑制了靶向受体的磷酸化，从而在体外抑制癌细胞增殖。该抗体经过增强Fc功能工程化改造，展现出强大的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。体内研究表明，抗VEGFA结构域的设计是药物疗效的核心，其中非可裂解连接子（linker）形式表现最佳，推测是由于肿瘤局部VEGF结合所致。在胰腺癌模型中，抗肿瘤活性主要由抗VEGF和抗EGFR活性驱动。此外，TAVO412展现出优于贝伐珠单抗（bevacizumab）或阿米凡他单抗（amivantamab）单药治疗的抗肿瘤活性，且在结直肠癌和食管癌模型中的疗效与两者联合治疗相当。结论： 综上，这些临床前研究结果为TAVO412在表达EGFR、cMET和VEGF的晚期胃肠癌患者中开展临床试验奠定了基础。

论文解读：TAVO412三特异性抗体在胃肠癌中的多重抗肿瘤机制与临床前疗效

一、研究背景与科学问题

胃肠（GI）恶性肿瘤涵盖食管癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌和胰腺癌等多种消化系统及附属器官肿瘤，占全球癌症病例的20%以上，是癌症相关死亡的主要原因之一。尽管靶向治疗和免疫治疗取得了进展，晚期患者的预后仍然不佳，传统化疗仍是多数患者的主要治疗选择。

EGFR（表皮生长因子受体）和cMET（间质-上皮转化因子，又称肝细胞生长因子受体）是参与细胞生长刺激的关键酪氨酸激酶受体，而VEGF（血管内皮生长因子）通过其受体VEGFR1和VEGFR2刺激局部血管生成。在胃肠癌中，这三条关键致癌驱动通路常共同失调并共表达，导致肿瘤增殖、转移和血管生成，并与更差的预后相关。流行病学调查显示，胃癌患者中EGFR过表达率为27%–64%，cMET为22%–82%，VEGF约为40%，支持同时靶向这些通路的策略。

然而，针对单一靶点的治疗在临床中屡遭挫折：抗EGFR抗体（西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗）及HGF/cMET靶向药物（利洛图单抗、奥那妥珠单抗）在II/III期试验中均未能改善生存。双特异性抗体amivantamab（抗EGFR-抗cMET）虽在非小细胞肺癌中获批，但在胃癌和食管癌的II期试验中仅对食管癌患者显示出有前景的结果，对胃癌患者效果不佳。在结直肠癌中，cMET过表达与抗EGFR药物耐药相关，但单特异性抗cMET抗体未改善生存。在胰腺导管腺癌（PDAC）中，EGFR和cMET共过表达与生存期差相关，尽管PDAC并非高度血管化肿瘤，但常表现出局部内皮增殖和VEGF过表达；EGFR TKI厄洛替尼仅带来适度生存获益，而西妥昔单抗和贝伐珠单抗在III期试验中联合化疗均未改善结局。

鉴于耐药肿瘤细胞增殖可能源于多个基因病变，研究人员设计了TAVO412——一种同时靶向EGFR、cMET和VEGF的三特异性抗体，以期解决晚期胃肠癌患者对多靶点联合治疗的需求。

二、研究设计与技术方法

研究人员构建了TAVO412，其结构包含双表位串联抗EGFR纳米抗体、一个靶向cMET胞外域的抗cMET Fab臂，以及一个靶向VEGF的scFv结构域，Fc区域经F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L突变增强Fc效应功能。主要技术方法包括：流式细胞术分析抗体与肿瘤细胞的结合亲和力；TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）法测定配体诱导的受体磷酸化抑制；Presto Blue?细胞活力实验评估增殖抑制；基于报告基因的替代ADCC和ADCP实验及LDH释放法检测CDC杀伤活性；多种皮下异种移植瘤（CDX）模型（包括胃癌MKN45、SNU-5，胰腺癌BxPC3，结直肠癌LIM1215，食管鳞癌KYSE450，以及BT20、H292等）评估体内抗肿瘤疗效；Western blot检测肿瘤组织及血清中受体降解和抗体裂解情况；ELISA检测细胞培养上清中VEGF分泌水平；QuantiBRITE? PE微球定量细胞表面EGFR/cMET受体密度。所有动物实验均经GenePharma机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

三、研究结果

3.1 TAVO412细胞结合与受体磷酸化抑制

流式细胞术分析显示，TAVO412对BxPC3、SNU-5和MKN45细胞系均表现出高亲和力结合（EC50为0.9–1.78 nM），与amivantamab相当。在EGFR高表达的BxPC3细胞上，TAVO412结合效力（EC50: 0.90 nM）优于amivantamab（1.94 nM）。TR-FRET实验表明，TAVO412有效阻断EGF和HGF诱导的受体磷酸化，其抑制EGFR磷酸化的效力（IC50: 1.18 nM）显著优于amivantamab（IC50: 8.00 nM），而两者抑制cMET磷酸化的效力相当（IC50分别为0.94 nM和0.91 nM）。

3.2 TAVO412通过EGFR/cMET双靶向抑制SNU-5细胞增殖

在无效应细胞的条件下，TAVO412（IC50: 2.65 nM；Span: 63.9%）对SNU-5胃癌细胞的增殖抑制效力和效果均优于amivantamab（IC50: 6.02 nM；Span: 47.7%）。通过构建单结合域缺失变体进行功能解析，发现在cMET高密度（349,700受体/细胞）的SNU-5细胞中，cMET结合臂是抗增殖反应的主要驱动因素（cMET缺失变体几乎无抑制活性，Span<5%），而EGFR臂缺失仍保留部分抑制活性（IC50: 25.97 nM；Span: 33.4%）。双价cMET单抗虽具抑制活性（IC50: 1.30 nM；Span: 35.8%），但动态范围窄于TAVO412，表明双受体同时结合赋予增强的亲合力效应。

3.3 TAVO412的ADCC、ADCP和CDC活性

TAVO412在三种肿瘤细胞系中均展现强效Fc效应功能。在ADCC方面，TAVO412在SNU-5（EC50: 0.176 nM）和BxPC3（EC50: 0.199 nM）细胞中效力优于amivantamab，在MKN45中两者相当。ADCP方面，TAVO412在三种细胞系中均优于amivantamab，尤其在SNU-5细胞中amivantamab无法检测到ADCP活性，而TAVO412保持高效力（EC50: 0.217 nM）。CDC方面，TAVO412在每种细胞系中均诱导显著CDC活性（EC50范围1.19–10.55 nM），而amivantamab无可检测CDC活性。通过变体解析发现，EGFR结合臂主导ADCP效力，而cMET臂的加入贡献于ADCP效果（响应幅度）。

3.4 抗VEGF结构域在TAVO412抗肿瘤疗效中的作用

在SNU-5和H292 CDX模型中，含抗VEGF scFv的TAVO412-cVEGF（经MMP可裂解连接子连接）的抗肿瘤效力始终优于不含VEGF结构域的TAVO412-EC（SNU-5中TGI 53.2% vs. 53.7%；H292中58.3% vs. 42.7%）。在MKN45和SNU-5胃癌模型中，TAVO412-cVEGF呈剂量依赖性肿瘤生长抑制（TGI 31.2%–66.8%和45.0%–67.3%），均优于同等剂量的amivantamab（TGI分别为16.1%和24.8%）。此外，TAVO412-cVEGF在给药后24小时诱导肿瘤内EGFR和cMET受体降解，揭示另一作用机制。

3.5 非可裂解连接子连接抗VEGF的抗肿瘤活性

比较MMP可裂解连接子（TAVO412-cVEGF）与非可裂解连接子（TAVO412）在BT20和MKN45 CDX模型中的疗效，TAVO412（非可裂解）在两种模型中均诱导更强的肿瘤生长抑制（MKN45中TGI 72.4% vs. 57.2%）。Western blot分析证实，TAVO412-cVEGF在无肿瘤的裸鼠血清中早在给药后4小时即发生系统性裂解，释放的抗VEGF scFv片段（约27 kDa）因分子量小可能被更快清除，从而削弱疗效。

3.6 抗VEGF是TAVO412在胰腺CDX模型中疗效的主要驱动因素

在BxPC3胰腺癌异种移植模型中，TAVO412（10 mg/kg）在首次给药后即诱导肿瘤停滞，TGI达80.5%，显著优于amivantamab（TGI 32.8%），且抑瘤效果持续至末次给药后17天。通过逐一沉默各功能域（以抗gp120替换或引入LALA突变沉默Fc）的对比研究发现，抗VEGF结构域是BxPC3模型中肿瘤生长控制的主导因素（去除后抗肿瘤活性完全消失），抗EGFR臂也发挥一定作用，而cMET臂和Fc效应功能在该模型中影响有限。TAVO412治疗诱导BxPC3肿瘤中cMET受体降解但未降解EGFR。

3.7 TAVO412在结直肠癌和食管鳞癌CDX模型中的抗肿瘤活性

在LIM1215结直肠癌模型中，TAVO412（10 mg/kg）实现TGI 90.4%，与amivantamab联合贝伐珠单抗的疗效（TGI 91.8%）相当，且两组均在所有小鼠中实现持续部分缓解（PR 5/5），优于两种单药（amivantamab TGI 78.6%，贝伐珠单抗 TGI 66.8%）。在KYSE450食管鳞癌模型中呈现类似疗效特征：TAVO412的肿瘤控制效果与联合治疗相当，优于任一单药，但两组均未达到PR。

四、讨论与结论

研究证实，TAVO412通过多种互补作用机制发挥抗肿瘤活性：抗cMET臂主导直接抗增殖效应，抗EGFR臂增强效果并介导Fc效应功能，抗VEGF结构域通过中和VEGF抑制血管生成。在BxPC3胰腺癌模型中，抗VEGF结构域是疗效的主要驱动因素，EGFR和cMET臂可能通过"归巢"效应增加抗体在肿瘤微环境中的局部浓度，从而增强抗VEGF活性。非可裂解连接子优于可裂解连接子，因后者在血液循环中发生非预期裂解，导致抗VEGF片段提前释放和快速清除。TAVO412单药疗效优于贝伐珠单抗或amivantamab单药，与两者联合治疗相当。这些临床前发现为TAVO412在表达EGFR、cMET和VEGF的晚期胃肠癌患者中开展临床试验奠定了基础。I期临床试验（NCT06761651）的初步数据显示，TAVO412耐受性良好，并在结直肠癌和食管鳞癌患者中展现出有前景的初步疗效。