猪反向基因对ABCF1与PPP1R10的分子特征及启动子活性分析

《Animals》：Molecular Characterization and Promoter Activity Analysis of the Porcine Convergent Gene Pair ABCF1 and PPP1R10

　　

反向基因对（convergent gene pairs）的基因间区在猪中常维持开放的染色质构象，并具有允许转录的微环境，使其成为基因组安全港（genomic safe harbors, GSHs）的候选区域。然而，反向基因对ABCF1与PPP1R10的分子特征及启动子活性尚未被表征，阻碍了其作为GSH潜力的利用。为此，研究人员通过生物信息学方法系统预测了两个基因的顺式调控元件（包括CpG岛），利用双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporter assays）在猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts, PFFs）和PK-15细胞中评估了系列截短启动子片段的转录活性，比较了七个物种间的启动子区域，并表征了蛋白质结构域架构及侧翼基因组景观。ABCF1启动子含有典型的TATA、CCAAT和GC盒以及三个CpG岛，其最短片段P217（?217至?1 bp）在两种细胞系中均表现出最高活性。PPP1R10启动子具有三重TATA盒排列，且未检测到CpG岛，其核心片段P211（?211至?1 bp）在所有截短片段中于两种细胞系中均表现出最高活性，并在PK-15细胞中显示出数值上高于猿猴病毒40（simian virus 40, SV40）启动子的活性。在两个基因间基因间区上下游100 kb范围内未鉴定到经典癌基因。ABCF1和PPP1R10均为缺乏跨膜结构域的胞内可溶性蛋白。ABCF1主要由α-螺旋构成，定位于细胞质和核膜，并调控胞质翻译。相比之下，PPP1R10富含无规卷曲，特异性结合核染色质，并参与PP1磷酸酶调控网络。综上，该研究 delineates 了两个基因的核心活性启动子区域，并凸显了该染色体区间作为候选基因组安全港位点的潜力，这一假说有待进一步实验验证。

论文解读

一、研究背景与意义

基因组安全港（genomic safe harbors, GSHs）是指能够实现外源基因稳定整合而不干扰宿主基因功能、不诱发致癌转化、也不导致转基因渐进性沉默的特定染色体区域。在猪的遗传改良、人类疾病模型构建和异种移植等应用中，将外源基因精准插入经过验证的GSH位点至关重要。然而，目前经过功能验证的猪GSH候选位点仍然有限，已报道的候选位点包括ACTB、GAPDH、H11安全港位点以及猪AAVS1同源区域。这些现有位点存在明显缺陷：基因内整合可能干扰内源基因功能，且多个所谓的安全位点在长期细胞传代过程中表现出逐渐的转基因沉默和表达异质性。因此，迫切需要鉴定和功能验证更多高质量的猪GSH候选位点。

过去十年间，影响血液细胞参数和T淋巴细胞亚群的免疫相关数量性状位点（quantitative trait loci, QTLs）在多个独立猪群体中被反复鉴定，其中多个信号定位到猪7号染色体。连续的全基因组关联研究（genome-wide association studies, GWASs）反复将该染色体与免疫相关性状关联，ABCF1和PPP1R10被鉴定为可能的候选位置基因。ABCF1编码一种缺乏跨膜结构域的胞质ATP结合盒蛋白，作为翻译起始调节因子，是先天免疫、炎症反应和抗病毒防御的重要调节因子。PPP1R10产生PNUTS蛋白，是PTW/PP1磷酸酶复合物的核心调节亚基，调控RNA聚合酶II暂停释放、转录延伸和MYC蛋白稳定性。值得注意的是，ABCF1和PPP1R10在猪7号染色体上形成一个典型的反向基因对，共享约6.5 kb的基因间区。尽管该基因对与猪免疫表型之间存在稳健的遗传关联，但猪ABCF1和PPP1R10的启动子结构和转录调控特征在很大程度上仍未表征，也没有研究评估该反向基因对周围的基因组区间是否可作为新型猪GSH候选位点。

二、主要技术方法

研究人员采用多种生物信息学工具与实验方法相结合的策略。在生物信息学预测方面，使用神经网络启动子预测工具（NNPP）预测核心启动子区域，MethPrimer鉴定CpG岛，FIMO结合JASPAR 2026 CORE数据库筛选转录因子结合位点，并与KnockTF 2.0数据库的实验调控证据进行比较。在实验验证方面，构建了ABCF1的六个系列截短启动子片段（P217至P2997）和PPP1R10的五个截短片段（P211至P2159），克隆至pGL3-Basic荧光素酶报告载体，在猪胎儿成纤维细胞（PFFs，来自大白猪胎儿，第3代）和猪肾上皮细胞系PK-15（第7代）中进行双荧光素酶报告基因实验，以pRL-TK海肾荧光素酶为内参，pGL3-SV40为阳性对照。蛋白质分析方面，利用ProtParam、ProtScale、SignalP 5.0、TMHMM 2.0、GOR4、InterPro和SWISS-MODEL等工具进行理化性质、信号肽、跨膜结构域、二级结构、保守结构域和三级结构同源建模分析，STRING数据库构建蛋白互作网络。

三、研究结果

3.1 猪ABCF1和PPP1R10的5′侧翼调控区域的生物信息学表征

ABCF1的5′侧翼区域呈现典型的真核启动子结构，包含9个有效顺式作用元件（1个TATA、3个CCAAT和5个GC盒）和3个CpG岛，预测到14个高置信度转录因子结合位点，其中MAFG::NRF1和SP1的结合预测最为显著。PPP1R10的5′侧翼区域包含4个有效顺式作用元件（3个TATA盒和1个CCAAT盒），具有近端串联TATA对，但未检测到符合标准的CpG岛，预测到18个高置信度转录因子结合位点，其中Spi1和FOXC1的预测结合最为显著。对基因间区中点为中心的±100 kb窗口内基因组背景分析鉴定到13个蛋白编码基因，均非已知癌基因。公共猪表观基因组数据显示基因间区携带一个同时标记ATAC、H3K27ac和H3K4me3的离散调控元件，而候选插入位点本身无标记调控峰。七个物种间启动子区域序列比较显示中等至较高保守性，平均一致性分别为60.39%和60.27%。

3.2 系列截短启动子片段的转录活性

双荧光素酶报告基因实验在PFFs和PK-15细胞中验证了所有截短启动子片段的转录活性。对于ABCF1，所有六个截短片段在两种细胞系中均显著高于SV40阳性对照，最短片段P217表现出最高活性，随片段长度增加转录活性逐渐下降。对于PPP1R10，五个截短片段活性差异显著，最短片段P211在两种细胞系中均表现出最高活性，且在PK-15细胞中数值上高于SV40阳性对照。结果表明两个基因的核心功能启动子均位于最短测试片段内，ABCF1约217 bp，PPP1R10约211 bp。

3.3 猪ABCF1和PPP1R10的理化性质与亚细胞定位

ABCF1为酸性蛋白（pI 5.94），PPP1R10为碱性蛋白（pI 9.25），两者均为亲水性蛋白，不稳定指数均高于40。两种蛋白均无经典分泌信号肽和跨膜螺旋，无连续疏水区段。ABCF1分布于细胞质、核膜和核质，PPP1R10特异性定位于细胞核，与染色质和PTW/PP1磷酸酶复合物相关联。

3.4 猪ABCF1和PPP1R10的二级结构、保守结构域与同源建模

ABCF1以α-螺旋为主（52.67%）和无规卷曲（37.50%），含有P-loop核苷三磷酸水解酶结构域（281–534 aa）和ABC转运蛋白特征结构域（604–819 aa）。PPP1R10以无规卷曲为主（69.41%），含有N端PP1调节亚基结构域、TFIIS/LEDGF结构域（35–158 aa）和C端CCCH/C3H1型锌指结构（891–919 aa）。SWISS-MODEL同源建模显示ABCF1采用刚性α-螺旋主导构象，PPP1R10采用柔性无规卷曲主导构象。

3.5 猪ABCF1和PPP1R10的蛋白互作网络、功能富集与跨物种保守性

ABCF1互作网络包含10个核心互作因子形成26条互作边，以核糖体大亚基和小亚基蛋白为中心节点，GO富集在核糖体多聚体（polysome）和胞质翻译（cytoplasmic translation）条目上高度显著。PPP1R10互作网络包含5个核心互作因子形成8条边，以PP1催化亚基PPP1CA、PPP1CB和PPP1CC为中心，GO富集在PTW/PP1磷酸酶复合物、糖原代谢过程和蛋白去磷酸化条目上显著。跨物种比较显示ABCF1总体平均序列一致性为89.94%，PPP1R10在哺乳动物内序列一致性均超过94%。

四、讨论总结与结论

讨论部分指出，ABCF1和PPP1R10启动子结构的对比为理解其转录调控提供了机制见解。ABCF1呈现典型真核启动子构型，与广泛表达基因相关；PPP1R10具有三重TATA盒且缺乏CpG岛，提示不同的调控逻辑。两个启动子均呈现“近端激活-远端抑制”模式，远端负调控元件可能防止过度表达破坏翻译稳态。ABCF1的MAX::MYC中心调控网络提示其转录与增殖细胞的翻译需求耦合。结构分析揭示了两种蛋白的生化分工：ABCF1为酸性、α-螺旋主导的刚性蛋白，参与翻译起始调节和先天免疫感知；PPP1R10为碱性、无规卷曲主导的柔性支架蛋白，组装PTW/PP1磷酸酶复合物，调控转录延伸和染色质调控。跨物种保守性分析表明核心功能结构域在进化上保守。该位点满足GSH的基本序列级标准：±100 kb侧翼窗口内无经典癌基因、稳定的基础转录活性和保守的调控架构。

结论部分总结，该研究首次系统表征了猪反向ABCF1-PPP1R10基因对，界定了最小功能启动子P217和P211，揭示了不同的启动子架构、互补的蛋白质结构和功能特性，以及无癌基因的±100 kb侧翼区域。这些发现为该区间作为新型猪基因组安全港候选位点提供了基础证据，但定点敲入和体内验证仍是确认其生物安全性和长期转基因表达稳定性所必需的。