《Animals》：Feasibility of Serum and Faecal Interleukin Assessment in Equine Surgical Colic: A Pilot Study
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细胞因子（cytokines）可能为马绞痛（equine colic）中的炎症状态提供信息，但其临床相关性仍不确定。本预试验研究评估了8匹接受绞痛手术的马及6匹健康对照马血清与粪便白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和IL-8的短期变化。
细胞因子（cytokines）可能为马绞痛（equine colic）中的炎症状态提供信息，但其临床相关性仍不确定。本预试验研究评估了8匹接受绞痛手术的马及6匹健康对照马血清与粪便白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和IL-8的短期变化。绞痛马于入院时（D0）、24 h（D1）及第7天（D7）采样；对照马于D0提供血清，并在全部三个时间点提供粪便。细胞因子采用MILLIPLEX与MAGPIX进行检测。3/8匹（37.5%）绞痛马入院时无法获得粪便。血清IL-1β与IL-6在每种细胞因子29/29份（100%）分析样本中均低于检测限。血清IL-8呈现明显变异，但无显著时间性变化。共分析39份粪便提取物，未对粪便检测方法进行验证。绞痛马粪便估算值总体较低，IL-6在D1（p = 0.045）、IL-1β在D7（p = 0.033）及IL-8在D7（p = 0.004）存在名义上的组间差异。未检测到粪便估算值的一致时间模式，亦未发现血清与粪便IL-8之间的显著关联。上述结果尚不能确立这些细胞因子用于临床监测的价值，并凸显了采样与分析方面的局限性，这些局限性应在更大规模、临床多样性更广的队列中加以解决。
**研究背景与问题**
绞痛（colic）是马匹急诊就诊与死亡的主要原因之一。胃肠道扩张、阻塞、移位与绞窄可导致局部组织损伤与炎症，重症病例可发生内毒素血症（endotoxaemia）与全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome）。临床检查、直肠触诊、超声检查及常规实验室检测仍是评估的核心手段，乳酸（lactate）与急性期蛋白（acute-phase proteins）等生物标志物可提供补充信息。寻找可重复、可快速检测且临床可及的附加标志物，有望改善急性腹部疾病的特征描述与监测。白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6与IL-8为功能互补的炎症介质：IL-1β参与炎症的启动与放大，IL-6介导急性期反应，IL-8促进中性粒细胞募集与活化。既往研究报道15匹接受绞痛手术的马在围手术早期三种细胞因子基因表达均升高，另一项155匹急性腹部疾病马的研究记录了血液与腹腔液IL-6活性升高。然而基因表达与生物学活性并不直接等同于蛋白浓度，细胞因子测定可随病变类型、样本材料、检测方法与采样时间而变化。人类研究中粪便细胞因子（如活动性炎症性肠病粪便IL-1β升高）为探索粪便作为潜在无创炎症标志物来源提供了依据，但这些发现并未验证马粪便细胞因子测定，马手术性绞痛中IL-1β、IL-6、IL-8及其时间变化的数据仍然有限。本研究旨在评估接受绞痛手术马血清与粪便IL-1β、IL-6、IL-8浓度的短期变化，并与健康马比较。研究假设绞痛马血清与粪便白细胞介素浓度高于健康马并与临床状态相关，预期术前及术后早期升高、随炎症消退而下降并接近健康马水平。该研究为探索性研究，未设计用于建立预后阈值或与病变严重程度的关联。
**主要技术方法**
研究纳入8匹需手术干预的急性绞痛马与6匹健康对照马，均来自波兰Equivet Szpital dla Koni。绞痛马于入院（D0）、24 h（D1）及第7天（D7）采样，对照马D0采血清、三个时间点采粪便。血清以促凝管采集、离心分离后?20 °C保存12 h再转?80 °C；粪便5 g与含1%蛋白酶抑制剂混合液的PBS混匀、离心、0.45 μm过滤后同样保存。采用MILLIPLEX MAP马细胞因子/趋化因子磁珠面板（EQCYTMAG93K）与Luminex MAGPIX分析仪双份测定，Belysa软件处理输出。统计分析采用Shapiro–Wilk检验、Student t检验、Mann–Whitney U检验、Friedman ANOVA及Spearman秩相关，并以精确双侧置换检验及Holm校正处理多重比较。
**研究结果**
3.1 马匹：对照组为2匹雌性、4匹雄性，绞痛组为4匹雌性、4匹雄性；平均年龄分别为8.0岁（6–10岁）与9.0岁（3–15岁）。全部为温血类型马。8匹绞痛马均未行肠切除。C8在24 h出现短暂恶化后恢复；C2与C12出现术后并发症，C16有轻度术后疼痛。全部8匹均随访至D7。D0时C2、C8、C9（3/8；37.5%）无法获得粪便样本，C8与C9为直肠内无粪便，C2为无法安全进行直肠检查，故样本缺失与急性胃肠道状况直接相关而非实验室处理所致。D1与D7全部绞痛马均有粪便样本；C9的D1血清样本损坏无法分析。入院时8匹绞痛马总蛋白（TP）、血细胞比容（HT）与白细胞计数（WBC）中位数（Q1–Q3）分别为6.90（6.50–7.10）g/dL、35.00（32.00–37.25）%与10.55（8.86–12.64）×10
9/L。
3.2.1 血清：血清IL-1β与IL-6在每种细胞因子29/29份（100%）分析样本中均低于检测限，均不可检出（0/29，0%）。共获得29份血清IL-8结果：6份来自健康对照（6/6），23份来自绞痛马（23/24）。血清IL-8呈明显个体间变异。D0对照组与绞痛组差异不显著（p = 0.165），绞痛组D0、D1、D7间无显著时间性变化（Friedman χ
2 = 0.857，p = 0.651；Kendall's W = 0.061）。
3.2.2 粪便：在39份可得粪便提取物（对照18/18，绞痛21/24计划样本）中测定粪便IL-1β、IL-6与IL-8，这些为6匹对照与8匹绞痛马的重复样本而非独立马匹。粪便细胞因子估算值呈明显个体间变异，多数细胞因子与时间点绞痛马中位数低于健康对照，但组间差异仅IL-6在D1（p = 0.045）、IL-1β在D7（p = 0.033）与IL-8在D7（p = 0.004）达到名义显著。两组内均未检测到粪便IL-1β、IL-6或IL-8的显著时间性变化（均p > 0.05），马匹间亦无一致的单向模式。
3.2.3 血清–粪便IL-8相关性：D0（Spearman ρ = 0.359，p = 0.567）、D1（ρ = 0.143，p = 0.783）与D7（ρ = 0.073，p = 0.887）均未检测到血清与粪便IL-8的显著相关。
3.2.4 D0细胞因子浓度与基础血液参数的关联：D0时经Holm校正后，细胞因子浓度与HT、TP或WBC的关联均未保持统计学显著。粪便IL-6在校正前与TP呈正相关（ρ = 0.975，n = 5，未校正p = 0.0333），但校正后不再显著（校正p = 0.400）。
**讨论与结论**
本预试验评估了接受绞痛手术马的短期血清与粪便细胞因子谱，未证实相对于健康对照升高并于D7恢复至相当水平的假设。血清IL-1β与IL-6低于检测限，血清IL-8与粪便估算值无一致时间模式，粪便值中孤立的名称性组间差异在分析局限性背景下需谨慎解读。重要的实际局限是8匹绞痛马中3匹（37.5%）入院时无法获得粪便，样本可得性取决于胃肠道状况与采集安全性；未测定肠道动力与传输，仅凭直肠无粪便不能确定胃肠道功能障碍的机制或严重程度；无法获得粪便的马可能在入院比较中被低估，可能引入选择偏倚，该比例不应推广至更广泛绞痛群体。粪便细胞因子估算值在生物学上也难以解释：绞痛马值总体未升高且个体间变异明显，健康对照较高值不应解读为更严重病理性肠道炎症的证据；远端采集的粪便可能不代表更近端的炎症节段，尤其在传输受损时，且可能反映急性发作前的肠腔状况而非采样时的炎症；肠腔流动改变与细胞因子降解可进一步削弱局部肠道炎症与粪便测定值之间的关系；粪便含水量差异也可影响比较，提取相同湿质量并未标准化干物质含量，较湿样本可能产生每体积提取物较低的浓度而不表示细胞因子生成减少；日粮、微生物群与局部免疫调节差异亦为基线变异的可能因素。这些细胞因子的多样生物学作用也提示将其存在解读为病理性炎症证据时需谨慎。如上所述，检测方法未针对马粪便提取物验证，提取回收率差异或检测干扰不能排除为观察变异的因素。C8与C16实施了肠切开术，但未评估这些操作与个体细胞因子估算值的关联，故观察到的组间差异应视为探索性而非肠道炎症相对严重程度的直接度量。就血清测定而言，已发表马研究间的差异可能反映检测平台、血清与血浆、疾病表型与采样时间的不同。细胞因子反应可能短暂：实验性内毒素血症可产生IL-1β、IL-6与IL-8基因表达的快速变化，绞痛手术后IL-8转录可在数小时内达峰；尽管转录变化不能直接确立蛋白动力学，入院、24 h与D7采样可能错过早期全身峰值。本发现不应解读为这些细胞因子未参与绞痛病理生理，而是在所采用的样本类型与时间窗内其临床效用无法确立。入院时细胞因子浓度经多重比较校正后与HT、TP或WBC无显著关联。临床异质性与治疗是变异的额外来源：纳入马匹有大小肠病变，病变位置、持续时间与绞窄状态的差异可影响细胞因子反应；未行肠切除，但C7可能的绞窄无法确认，该队列不应被归类为完全非绞窄性；8匹纳入马均未被认为危重或显示内毒素血症或明显血流动力学受损的临床征象，限制了对全身受累更严重马的推断；入院血细胞比容值（中位数35%；范围31–43%）未提示明显血液浓缩，但仅凭血细胞比容不能排除灌注受损或全身炎症；转诊前及后续院内治疗可能改变细胞因子反应；由于全部绞痛马在D0采样前已接受药物与液体治疗，入院测定不代表未经治疗的基线；晶体液治疗还可能通过血液稀释影响血清浓度；治疗为个体化，其效应无法量化或被视为血清IL-1β与IL-6不可检出结果的既定解释。从临床角度看，样本制备尤其粪便提取物、过夜孵育及对专业实验室设备的需求，限制了该方法用于急性绞痛即时决策的适宜性；多重检测成本也可能限制常规使用；尽管周转时间与成本未正式评估，在评估这些测定对术后监测的潜在价值时两者均应考虑。小型探索性队列限制了统计效能、精度与亚组评估，非显著发现不能证明不存在关联。10月1日至3月31日期间，19匹就诊绞痛马最初纳入研究，其中3匹死亡、2匹安乐死，总体非存活率为26.3%（5/19）；部分马未手术、部分提前出院、部分因各种原因未能按研究计划获得足够连续样本，最终分析队列减至8匹随访至D7的手术治疗马。与存活、出院时间及样本可得性相关的排除引入潜在选择偏倚，限制了对更广泛手术性绞痛群体尤其重症或致死病例的推广。血液与腹腔液乳酸测定不完整且未纳入分析，限制了对细胞因子与灌注及代谢状态关系的评估，乳酸可提供低灌注与代谢应激的补充信息。除上述采样、治疗与粪便检测局限外，未评估所采用处理条件下细胞因子的稳定性。未来研究应纳入跨越更广严重程度谱的更大队列，记录治疗与采样时间，纳入系统乳酸测定，并在评估临床效用前对每种样本类型评估提取回收率、稀释线性、干扰与稳定性。
研究结论：本预试验研究未能确立血清或粪便IL-1β、IL-6与IL-8用于监测手术性绞痛马临床状态与术后恢复的价值。粪便采样提供了潜在无创途径，但其在入院时的应用受限于部分绞痛马无法获得粪便材料。在检测方法未针对马粪便提取物验证的情况下，绞痛马粪便估算值的名称性降低不能解读为肠道炎症较少的证据。进一步评估需要经验证的测定方法及跨越更广疾病严重程度范围的更大队列，并考虑治疗效应与采样时间。
