《Heliyon》：Multi-epitope vaccine eliciting robust immune responses against diverse Crimean-Congo hemorrhagic fever virus strains targeting the glycoprotein and RNA polymerase: An immunoinformatics-driven approach
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克里米亚-刚果出血热是一种由蜱传播的严重致死性疾病，报告病死率高达40%。由于其在30余个国家具有流行潜力，世界卫生组织（WHO）将其列为优先关注对象；目前该病缺乏有效治疗手段，因此疫苗的紧急研发至关重要。本研究采用先进的免疫信息学驱动策略，设计了一种靶向多种
克里米亚-刚果出血热是一种由蜱传播的严重致死性疾病，报告病死率高达40%。由于其在30余个国家具有流行潜力，世界卫生组织（WHO）将其列为优先关注对象；目前该病缺乏有效治疗手段，因此疫苗的紧急研发至关重要。本研究采用先进的免疫信息学驱动策略，设计了一种靶向多种克里米亚-刚果出血热病毒株的多表位亚单位疫苗。所提出的疫苗构建体经预测具有高抗原性、非致敏性及无毒性的特点，具备在宿主体内激发强烈体液免疫与细胞免疫应答的潜力。最终疫苗构建体整合了6个细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位、3个辅助性T淋巴细胞（HTL）表位及2个B细胞表位，上述表位经预测具有抗原性、非致敏性与无毒性，估计全球人群覆盖率为99.31%。结构质量评估显示，93.1%的残基位于最适Ramachandran区域，ERRAT评分为98.81，全局平均pLDDT评分为74.63。分子对接与300 ns分子动力学（MD）模拟预测该疫苗构建体与Toll样受体3（TLR3）及Toll样受体4（TLR4）之间具有良好相互作用潜力，且所建模的受体-疫苗复合物行为稳定。免疫模拟预测了其激发体液与细胞免疫应答的潜力，而密码子优化表明其在大肠杆菌（Escherichia coli）K-12中具有良好表达前景。总体而言，上述发现支持该广谱候选疫苗的潜力，并值得进一步实验验证。
克里米亚-刚果出血热（CCHF）由克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）引起，该病毒属布尼亚病毒目（Bunyavirales）内罗病毒科（Nairoviridae），是一种蜱传致死性病毒性疾病。全球系统综述与荟萃分析报告其平均周期性病死率约为28.8%，超过登革热（低于1%）并可堪比埃博拉（约50%）。CCHF地理分布已扩展至亚洲、中东、非洲与欧洲，然而迄今尚无获批疫苗或抗病毒治疗药物，亟需有效预防策略。CCHFV为有包膜、多形性、单股负链三分节段RNA病毒，基因组分为小（S）、中（M）、大（L）三个节段，分别编码核蛋白（NP）、糖蛋白Gn与Gc及黏蛋白样结构域GP38和NSm、RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）及卵巢肿瘤蛋白酶（OTU）。三个节段在不同分离株间分别呈现20%、31%和22%的序列差异，凸显其高度遗传变异性；基于S节段的系统发育研究已揭示7个遗传上不同的进化支，这是通用疫苗研发的主要障碍。既往多数计算疫苗设计依赖有限毒株数据集或以参考株为中心，因此整合跨遗传多样性谱系保守表位的策略对提高广谱覆盖尤为关键。基于此，研究人员采用免疫信息学框架，结合表位预测、结构建模、分子对接、分子动力学模拟与免疫模拟等计算方法，设计靶向CCHFV的稳健、强效、广谱多表位疫苗构建体，以期桥接CCHFV疫苗研发缺口，增强对不同基因型的广谱保护。
研究人员从美国国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank与基因组数据库检索S、M、L三个关键结构蛋白序列，依据S节段系统发育分类选取覆盖非洲、亚洲、欧洲的7个代表性进化支（I–VII）毒株，并纳入全基因组已充分表征的IbAr10200株；采用Clustal Omega进行多序列比对（MSA）。主要关键技术方法包括：①抗原性与致敏性预测（VaxiJen v3.0、AllerTOP v2.1）；②表位预测，包括IEDB B细胞表位工具（Bepipred-2.0、Kolaskar-Tongaonkar法及灵活性、β转角、表面可及性、亲水性参数）、NetMHCpan 4.1（27种参考HLA等位基因）预测CTL表位、Consensus 2.2预测HTL表位，并以ToxinPred、IFNepitope、IL4pred、IL-10Pred进行安全性及细胞因子诱导筛选；③IEDB人群覆盖率分析；④疫苗构建体设计（β-防御素3或50S核糖体蛋白L7/L12佐剂，AAY、GPGPG、KK、EAAAK连接肽及His标签）；⑤理化性质（ProtParam、SOLpro）与翻译后修饰、内在无序区分析；⑥二级结构预测（PSIPRED、GOR IV）；⑦三维建模（AlphaFold 3、ROBETTA）与GalaxyRefine精修及PDBSUM、ProSA-web、PROCHECK、ERRAT验证；⑧构象B细胞表位预测（ElliPro）；⑨分子对接（LightDock、PRODIGY、PDBSUM）与300 ns全原子分子动力学模拟（GROMACS 2024.4，CHARMM36力场），并开展主成分分析（PCA）、动态交叉相关矩阵（DCCM）、埋藏表面积（BSA）及CoCoMaps 2.0界面分析；⑩JCAT密码子优化与SnapGene体外克隆；?C-ImmSim免疫模拟。样本队列来源为NCBI公共数据库病毒序列，不涉及人体样本。
研究结果如下。3.1 序列多样性与保守抗原区域：Clustal Omega分析显示S、M、L节段相似性分别为94.19–100%、73.66–100%、94.65–100%，M节段变异最大；VaxiJen评分显示S节段抗原性为0.3068（低于0.4阈值），M与L节段分别为0.5155与0.4316，且三者均非致敏，故S节段未纳入下游分析。3.2 保守B细胞表位鉴定：经多参数严格过滤，从180个候选表位中最终获得2个兼具强抗原性、无毒与非致敏性的B细胞表位（SQQQNK、VSAKHNDGNLKDRSDDDQRLA）。3.3 保守T细胞表位筛选：NetMHCpan预测获得131个MHC-I（CTL）表位，Consensus 2.2预测获得148个MHC-II（HTL）表位；对40个MHC-II表位进行细胞因子诱导评估，8个表位显示诱导IL-4、IL-10与IFN-γ潜力，最终选取6个CTL与3个HTL表位用于疫苗构建。3.4 全球人群覆盖：所选HTL与CTL表位组合的全球覆盖率达99.31%，欧洲（99.85%）与北美（99.58%）最高，中非（85.36%）与东非（88.66%）略低但仍具广泛识别潜力。3.5 多表位疫苗构建体设计：设计疫苗A（β-防御素3佐剂，238个氨基酸）与疫苗B（50S核糖体蛋白L7/L12佐剂，314个氨基酸），以AAY、GPGPG、KK及EAAAK连接肽偶联表位并附His标签。3.6 理化特征：疫苗B分子量33.62 kDa、pI 6.56、GRAVY ?0.032、不稳定指数33.3、脂肪族指数92.77、SOLpro溶解度0.98、IEDB免疫原性评分0.45，均优于疫苗A；两者均无N-糖基化位点与信号肽，疫苗B存在1个潜在O-糖基化位点，内在无序区主要位于连接肽区域。3.7 二级结构：疫苗B α螺旋含量53.18%（疫苗A为26.89%），提示更高结构稳定性。3.8 三维结构建模与精修：AlphaFold 3所建疫苗B模型全局平均pLDDT为74.63，表位富集区局部pLDDT超过80；经GalaxyRefine精修后MolProbity评分0.804、冲突评分1，GDT-HA均高于0.93。3.9 结构验证：疫苗B的Ramachandran最适区残基占93.1%，仅Asp141位于不允许区；ERRAT评分98.81，ProSA-web Z评分?2.48，整体G因子0.05，结构质量优于疫苗A，故选择疫苗B进行后续对接与动力学分析。3.10 构象B细胞表位定位：ElliPro识别出多个突出指数（PI）超过0.5的不连续抗原簇，关键表面残基包括L300（PI=0.843）、M1（0.827）、K254（0.800）、A61（0.727）与A40（0.709）。3.11 疫苗B与TLR3、TLR4的分子识别：LightDock盲对接获得有利结合构象，PDBSum分析揭示了氢键、盐桥与非键接触等界面相互作用。3.12 结合热力学：PRODIGY预测疫苗-TLR3与疫苗-TLR4的ΔG分别为?23.0与?16.7 kcal/mol，表明两复合物热力学有利。3.13 复合物结构稳定性与动态行为：300 ns模拟显示TLR3-疫苗B复合物RMSD稳定于0.75–1.0 nm，TLR4-疫苗B复合物波动至约1.5 nm；TLR3复合物维持更多分子间氢键（20–30个）；RMSF显示最大波动主要位于疫苗N端佐剂域与连接肽区，而CoCoMaps识别的保守界面残基波动较低；PCA与DCCM表明两复合物构象采样稳定且保持动态通讯；BSA分析显示TLR3-疫苗B复合物埋藏表面积（4846±483 ?2）与界面面积（2423±241 ?2）均大于TLR4复合物，且界面残基对在0、100、200、300 ns快照中保持保守。3.14 密码子优化与克隆：JCAT优化获得945个核苷酸的DNA序列，密码子适应指数（CAI）0.992、GC含量53.71%，符合大肠杆菌K-12高效表达要求；经NruI与EcoRV位点插入pET-28a(+)载体，重组质粒全长6589 bp。3.15 免疫应答模拟：C-ImmSim预测疫苗可诱导强于初次应答的二次与三次免疫应答，IgG1、IgG2与IgM水平升高并伴随抗原水平显著下降，记忆B细胞扩增、同种型转换、CD4+与CD8+ T细胞增殖及记忆亚群形成，巨噬细胞与树突状细胞活性增强，IFN-γ与IL-2分泌显著升高。
讨论部分指出，疫苗接种是预防传染病的高效医学干预手段，但传统疫苗方法存在资源密集与耗时等局限；免疫信息学驱动设计可精简流程、降低前期实验筛选负担，已有多项计算设计的多表位疫苗进入体外与体内实验评估。WHO已将CCHF列为亟需研发对策的优先疾病。本研究针对既往设计多依赖单一参考株、有限序列数据集或未明确应对系统发育多样性的局限，采取多毒株、多谱系表位选择策略，纳入跨进化支保守免疫原性区域，所选表位来源于对病毒入侵、复制与转录至关重要的糖蛋白与RNA聚合酶相关区域；S节段因抗原性较低未被优先选用。研究强调CTL表位对长期免疫与清除感染细胞的重要性及HTL表位对CD4+ T细胞活化、增强CD8+记忆T细胞与B细胞应答的作用；构象B细胞表位分析揭示 refined 结构中多个溶剂可及的离散抗原区域，支持体液免疫原性。讨论同时指出人群覆盖率分析未考虑表位加工效率、免疫优势与宿主免疫变异性等因素，结果应视为初步估计；AAY、GPGPG、KK与EAAAK连接肽及β-防御素3、L7/L12佐剂的选择基于其已报道的免疫调节与抗原呈递增强特性，而非作为TLR3/TLR4特异性配体。疫苗B在理化稳定性、溶解度（0.985 vs. 0.768）、免疫原性（0.450 vs. ?1.154）及α螺旋含量（53.18% vs. 26.89%）方面优于疫苗A；对接与动力学模拟支持其与TLR3及TLR4的相互作用潜力，界面稳定性由多种弱分子间相互作用共同维持而非依赖单一作用类型，高全局RMSD主要归因于多表位疫苗结构的固有动力学而非复合物不稳定。密码子优化提示良好翻译效率，但大规模重组表达仍可能面临折叠不当、包涵体形成与产量波动等挑战。研究局限性包括：全部工作基于in silico分析，免疫原性、抗原性、结构稳定性与受体相互作用需体外与体内实验验证；计算方法难以完全反映生理条件下抗体-抗原相互作用复杂性；RNA病毒持续进化可能产生数据集未覆盖的区域变异；TLR4等先天免疫受体多态性可能影响不同人群的疫苗反应；尚需大规模基因组分析、重组表达研究、动物模型与临床验证评估长期安全性、免疫原性、交叉保护效力与更广泛适用性。该方法亦可为其他出血热病毒疫苗研发提供蓝图，纳米颗粒递送系统与mRNA疫苗平台有望进一步优化抗原呈递与免疫激活。
结论部分译文：本研究采用整合性免疫信息学驱动策略，设计了靶向遗传多样性CCHFV谱系的多毒株、多表位候选疫苗。通过纳入来源于多个系统发育进化支的保守B细胞、辅助性T细胞与细胞毒性T细胞表位，所提出的疫苗构建体在抗原性、结构稳定性、人群覆盖率及免疫受体相互作用潜力方面展现出良好的计算特征。结构建模、分子对接、MD模拟、界面分析与免疫模拟分析共同提示该设计构建体具有诱导针对CCHFV的体液与细胞免疫应答的潜力。在所评估的构建体中，疫苗B的理化与结构特性相对更优，支持其被选为进一步研究对象。尽管计算结果令人鼓舞，该候选疫苗本质上仍属预测性质，需通过重组表达、体外免疫学试验、动物模型研究与临床评估进行广泛实验验证，以确认其安全性、免疫原性与保护效力。尽管如此，本研究凸显了免疫信息学驱动方法作为宝贵初步框架、加速针对CCHFV等新发及遗传多样性病毒病原体疫苗发现的潜在效用。
