《Tropical Medicine and Infectious Disease》：Cross-Species Evaluation of Mycobacterium tuberculosis Complex Molecular Diagnostic Kits for Human and Veterinary Use: Introducing the One Health Perspective into Laboratory Diagnosis
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背景：针对结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）的分子检测试剂盒目前分别针对人类和兽医用途进行验证与授权，尽管它们靶向的是同一病原体的保守序列。这种分离主要源于监管而非生物学原因，限制了现有诊断
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背景：针对结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）的分子检测试剂盒目前分别针对人类和兽医用途进行验证与授权，尽管它们靶向的是同一病原体的保守序列。这种分离主要源于监管而非生物学原因，限制了现有诊断工具在不同场景中的灵活使用，尤其在中低收入国家。研究人员评估了一款人用和一款兽用MTBC实时荧光定量PCR（real-time PCR）试剂盒在非目标宿主临床样本中是否仍能检测MTBC。方法：人类样本（n = 108，Xpert MTB/RIF Ultra阳性）和牛样本（n = 100，MGIT培养阳性）使用同一DNA提取物分别以Viasure（人用）和ID Gene（兽用）试剂盒进行检测。比较各试剂盒相对于参考方法的灵敏度、试剂盒间一致性及配对Cq值。结果：在人类样本中，ID Gene的灵敏度为88.9%（95% CI 81.4–94.1），Viasure为77.8%（68.8–85.2）（p = 0.002）。所有检测失败均发生在41份储存时间较长且经历额外冻融循环的样本中，未发现PCR抑制证据；其余67份样本的灵敏度分别为98.5%和100%。在牛样本中，两种试剂盒灵敏度相当（74.0% [64.3–82.3] 与75.0% [65.3–83.1]；p = 1.000）。试剂盒间一致性在人类样本中为87.0%（κ = 0.54），牛样本中为91.0%（κ = 0.76）。在两种试剂盒均检出的样本中，ID Gene的扩增早于Viasure，人类和牛样本中的差异幅度相似（中位数分别为2.5和2.7个循环；p < 0.001）。结论：两种试剂盒均能在非目标宿主样本中检测MTBC，其相对性能与宿主物种无关；灵敏度差异可由样本储存和DNA载量解释，而非宿主相关因素。这些发现支持以One Health方法验证MTBC分子诊断工具，同时需以MTBC阴性样本确认跨宿主特异性。
论文解读文章
一、研究背景与问题
结核病（Tuberculosis，TB）是全球最重要的人兽共患传染病之一，对人类健康、动物健康和粮食安全构成持续威胁。结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）包括结核分枝杆菌（M. tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）、山羊分枝杆菌（M. caprae）、非洲分枝杆菌（M. africanum）等密切相关的物种，尽管宿主偏好和流行病学模式存在差异，其基因组核苷酸一致性超过99.9%。结核分枝杆菌是人类结核病的主要病原体，而牛分枝杆菌在牛及其他动物中仍是重要病原体，并在中低收入国家持续引起人兽共患结核病。人畜界面的传播是双向的，表明结核病并非严格的物种特异性疾病，而是跨生态系统的共同问题。
尽管分子诊断方法，特别是基于聚合酶链反应（PCR）的检测技术，已极大改善了结核病诊断的及时性和灵敏性，但商业化的MTBC分子检测试剂盒通常分别针对人类或动物用途进行开发、验证和销售。这种分割主要由监管框架、预期用途声明和验证队列所驱动，而非病原体本身的根本差异。因此，标称“人用”或“兽用”的诊断工具常被假定具有宿主特异性，即使它们靶向相同的保守MTBC序列和相同的组织或体液样本类型。这种人为分割限制了诊断工具在资源受限环境、人兽共患病调查或综合监测系统中的灵活使用。
从One Health视角出发，人医与兽医结核病诊断的人为分离是一个错失的机会。One Health强调人类、动物和环境健康的相互关联性，呼吁对复杂传染病挑战采取综合解决方案。然而，目前缺乏实证证据评估市售MTBC诊断试剂盒在应用于非目标宿主物种临床样本时是否表现同样良好。本研究正是源于厄瓜多尔实验室的真实经历——研究人员在某研究项目中只能获得兽用MTBC PCR试剂盒而需检测人类样本。评估这些试剂盒在非目标宿主样本中是否仍能检测MTBC DNA，是确定其跨宿主使用是否具有生物学合理性的必要第一步。
二、研究设计与方法概述
本研究为一项跨宿主评估，比较了两款商业实时荧光定量PCR试剂盒的检测能力：VIASURE结核分枝杆菌复合群实时PCR检测试剂盒（Certest Biotec，西班牙萨拉戈萨，简称“Viasure”），标注用于人类临床样本；以及ID Gene?结核分枝杆菌复合群Duplex试剂盒（ID.vet，法国蒙彼利埃，简称“ID Gene”），标注用于动物样本。研究纳入108份人类临床样本（来自厄瓜多尔瓜亚基尔传染病医院，96份呼吸道样本和12份非呼吸道样本，均为Xpert MTB/RIF Ultra阳性）和100份牛临床样本（来自西班牙埃斯特雷马杜拉大学兽医学院和埃斯特雷马杜拉地区动物卫生实验室的干酪样淋巴结病变脓液，均为MGIT培养阳性）。所有样本采集于2023年2月至2024年2月。人类样本中41份为最早采集的样本，储存时间较长且经历了额外冻融循环。DNA提取使用PureLink?基因组DNA小量提取试剂盒（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific），从200 μL热灭活样本中提取，洗脱于50 μL缓冲液。两种试剂盒均按制造商说明使用，同一DNA提取物同时用于两种试剂盒检测，所有反应在CFX96实时PCR系统（Bio-Rad）上运行。Viasure试剂盒扩增IS6110和IS1081插入序列（FAM通道），含内部对照（HEX通道），Ct < 40判定为阳性；ID Gene试剂盒扩增制造商未披露的MTBC基因组靶序列（FAM通道），未设Cq截止值。统计分析包括Clopper–Pearson精确置信区间、McNemar精确检验、Cohen's kappa系数、Wilcoxon符号秩检验、Mann–Whitney U检验和Fisher精确检验，使用R 4.5.3软件进行分析。
三、研究结果
3.1 灵敏度比较
在人类样本中，ID Gene检出96份（灵敏度88.9%；95% CI 81.4–94.1），Viasure检出84份（灵敏度77.8%；95% CI 68.8–85.2），兽用试剂盒的灵敏度显著高于人用试剂盒（McNemar检验，p = 0.002）。在牛样本中，ID Gene检出74份（74.0%；95% CI 64.3–82.3），Viasure检出75份（75.0%；95% CI 65.3–83.1），两种试剂盒灵敏度相当（p = 1.000）。
3.2 试剂盒间一致性
在人类样本中，83份两种试剂盒均检出，13份仅ID Gene检出，1份仅Viasure检出，11份均未检出，总体一致性为87.0%（94/108；95% CI 79.2–92.7），Cohen's kappa为0.54（95% CI 0.32–0.77），属中等一致性。在牛样本中，70份两种试剂盒均检出，4份仅ID Gene检出，5份仅Viasure检出，21份均未检出，总体一致性为91.0%（91/100；95% CI 83.6–95.8），kappa为0.76（95% CI 0.62–0.91），属高度一致性。4份牛样本出现Viasure晚期扩增（Ct 40.2–43.1），按制造商标准（Ct < 40）判定为阴性，ID Gene也将其全部判定为阴性。
3.3 配对Cq值比较
在两种试剂盒均检出的样本中，ID Gene的Cq值在人类样本中（中位数26.7 [IQR 23.3–30.2] vs. 28.6 [IQR 23.6–31.6]；中位配对差异?2.5个循环；Wilcoxon符号秩检验，p < 0.001）和牛样本中（中位数33.3 [IQR 31.8–34.5] vs. 35.7 [IQR 34.4–37.2]；中位配对差异?2.7个循环；p < 0.001）均低于Viasure。因此，两种试剂盒的相对性能与样本来源宿主物种无关。不一致结果集中在高Cq值区域：人类样本中仅ID Gene检出的13份样本Cq值介于30.4至37.8之间（中位数32.6），而两种试剂盒均检出的样本中位数为26.7（Mann–Whitney检验，p < 0.001）。牛样本整体Cq值高于人类样本（两种试剂盒均检出的样本中，ID Gene中位Cq为33.3 vs. 26.7），与牛病灶中细菌DNA载量较低一致。
3.4 事后分层分析
所有人类样本中的检测失败均集中在41份储存时间较长且经历额外冻融循环的样本子集中。在该子集中，ID Gene和Viasure的灵敏度分别为73.2%（30/41；95% CI 57.1–85.8）和41.5%（17/41；95% CI 26.3–57.9）（McNemar检验，p < 0.001），且两种试剂盒均未检出的11份样本全部属于该子集。相比之下，其余67份人类样本中，ID Gene灵敏度为98.5%（66/67；95% CI 92.0–100），Viasure为100%（67/67；95% CI 94.6–100）（p = 1.000）。两个子集间的灵敏度差异对两种试剂盒均显著（Fisher精确检验，p < 0.001）。Viasure内部对照在该子集所有样本中均正常扩增（仅1份出现延迟扩增，Cq 33.5 vs. 中位数24.0），排除了PCR抑制作为失败原因。
3.5 样本类型分析
未发现样本类型与人类样本检测结果之间的关联。ID Gene和Viasure在痰液样本中的灵敏度分别为88.2%（82/93）和76.3%（71/93），在其他样本类型中分别为93.3%（14/15）和86.7%（13/15）（Fisher精确检验，p = 1.000和p = 0.513）。
四、讨论与结论
本研究表明，人用和兽用MTBC实时PCR试剂盒均能在非目标宿主物种的临床样本中检测MTBC DNA。在未经长期储存的人类样本中，两种试剂盒几乎检出所有Xpert MTB/RIF Ultra阳性样本（ID Gene为98.5%，Viasure为100%），在牛样本中两种试剂盒对MGIT培养的灵敏度相当（74.0%和75.0%）。两种试剂盒间的Cq差异在人类和牛样本中几乎相同（中位数分别为?2.5和?2.7个循环），表明宿主物种不影响试剂盒的相对性能。人类样本中观察到的较低总体灵敏度，尤其是Viasure，完全归因于41份储存时间较长且经历额外冻融循环的样本子集。储存和反复冻融已知会损害分枝杆菌DNA的完整性及其PCR检测能力。此外，人类样本的参考方法Xpert MTB/RIF Ultra在新鲜样本上运行，其检测限极低（15.6 CFU/mL），因此低菌载量样本可能保持Ultra阳性但在降解的储存样本中低于PCR检测限。在该子集中，ID Gene检出率显著高于Viasure（73.2% vs. 41.5%），可能反映其更高的分析灵敏度或对DNA片段化的更高耐受性。
牛样本中两种试剂盒的灵敏度（约75%）低于文献报道的直接实时PCR检测牛组织与培养比较的96.5%。牛样本中观察到的高Cq值（两种试剂盒均检出的样本中ID Gene中位数为33.3）表明大多数样本中MTBC DNA含量接近两种检测方法的检测限，这可能反映了许多牛病灶的少菌特性、使用200 μL小体积脓液而非组织匀浆以及样本储存和运输的前分析因素。这些因素对两种试剂盒的影响相同，不一致结果在两者间均匀分布，因此不会偏倚本研究跨宿主比较的核心目标。
兽用试剂盒的较早扩增及其在人类样本中的较高检出率可能被解读为非特异性扩增。然而，本研究纳入的所有样本均经独立参考方法确认为MTBC阳性，因此任一试剂盒的检出均代表真阳性而非交叉反应。此外，在牛样本中观察到相同的试剂盒间Cq差异，且两种试剂盒检出比例相似，这些发现更符合ID Gene更高的分析灵敏度而非宿主依赖性或非特异性扩增。
本研究未纳入MTBC阴性样本，因此未估计特异性，这是与研究目标一致的设计选择——本研究并非对每种试剂盒进行独立的全面诊断准确性评估，而是评估每种试剂盒应用于非目标宿主样本时MTBC检测是否得以维持。MTBC PCR检测的特异性由MTBC以外生物体中靶序列的缺失决定，而非样本来源的宿主物种。然而，人类和动物临床样本中存在的非结核分枝杆菌和其他微生物可能不同，基于IS6110的PCR与某些环境分枝杆菌的交叉反应已在牛组织中有报道。因此，在常规跨宿主使用前，应以各宿主的MTBC阴性样本确认特异性。
从One Health视角看，本研究结果具有实际意义。诊断试剂盒虽靶向同一病原体且能在其他宿主样本中检测该病原体，但仍分别针对人医和兽医用途进行验证和授权。这些监管路径而非生物学差异，目前阻止了实验室使用可获得的兽用试剂盒分析人类样本或反之。这种分离尤其影响中低收入国家，这些国家诊断试剂短缺常见。将跨宿主适用性纳入人兽共患病原体（如MTBC）分子诊断的验证和授权考虑，可提高诊断系统的灵活性和韧性，并促进人畜界面人兽共患结核病的综合监测。
研究结论：人用Viasure和兽用ID Gene MTBC实时PCR试剂盒均能在非目标宿主物种的临床样本中检测MTBC DNA，其相对性能与宿主物种无关。这些发现为采用One Health方法验证和使用MTBC分子诊断提供了生物学支持，但仍需包括MTBC阴性样本在内的进一步研究以确认跨宿主特异性。
