可注射三甲基壳聚糖水凝胶递送辣椒素缓解骨关节炎动物模型中的功能性疼痛与血管-成骨耦联

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Injectable Trimethyl Chitosan Hydrogel with Capsaicin Mitigates Functional Pain and Angio-Osteogenic Coupling in an Animal Model of Osteoarthritis

摘要专业翻译 骨关节炎（Osteoarthritis, OA）仍是全球范围内导致残疾的主要原因之一，现有治疗手段仅限于症状缓解。本研究开发并评估了一种基于N,N,N-三甲基壳聚糖（N,N,N-trimethyl chitosan, TMC）的热响应水凝胶系统，用于辣椒素（capsaicin）的关节腔内持续递送——辣椒素是一种已确立的镇痛剂。本研究重点评估该系统的生物相容性、抗炎效果及其在动物模型中对功能恢复的影响。研究人员配制了一种热响应水凝胶（1% TMC，10% β-甘油磷酸钠），可在37 °C下稳定凝胶化。通过大鼠关节软骨细胞和巨噬细胞的细胞计数实验评估生物相容性。通过转棒实验（rotarod performance）及单碘乙酸（monoiodoacetate, MIA）诱导的大鼠OA模型中软骨完整性的组织学评估来评价治疗效果。通过免疫荧光分析巨噬细胞极化。在体外实验中，TMC水凝胶成功提高了辣椒素的生物相容性，同时显示出促炎性（M1）巨噬细胞极化的偏移，表现为CD86+细胞减少25%，而CD206+细胞增加30%。此外，该组在治疗后4周内表现出持续的转棒潜伏期改善。组织病理学评分证实了这些功能改善，接受负载辣椒素的TMC水凝胶治疗的OA动物模型平均评分仅为2分，而未治疗对照组为6分。免疫荧光分析显示，与对照组相比，血管生成标志物和白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）炎症标志物显著减少。TMC-辣椒素水凝胶系统作为一种生物相容性的局部可注射OA治疗手段展现出良好前景。该系统与功能表现改善、关节保护、炎症标志物表达降低以及软骨组织完整性保留相关联。

论文解读

一、研究背景与意义

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是全球最常见的慢性关节疾病之一，以关节软骨、软骨下骨、韧带、关节囊和滑膜的进行性结构退化为特征，最终导致软骨及其他关节周围组织的破坏。2020年OA影响了全球约7.6%的人口，且随着社会老龄化其患病率持续上升。尽管OA造成了长期且广泛的全球负担，但目前仍无根治性治疗方法。软骨因细胞稀少且无血管分布而极难再生，有限的修复通常形成质量较差的纤维软骨。现有治疗策略包括生活方式干预和以缓解疼痛、改善功能为目标的药物治疗，手术干预仅在上述措施失败后作为最后手段。

壳聚糖及其衍生物在先进生物材料药物递送领域展现出良好前景。然而，壳聚糖在正常生理pH值（6.5及以上）下溶解度低，限制了其在需要正常生理条件场景中的应用。这一限制可通过化学修饰的壳聚糖——N,N,N-三甲基壳聚糖（TMC）来克服。TMC是通过壳聚糖主链上氨基的季铵化合成的高阳离子衍生物，在更宽的pH范围内具有高溶解度，且其永久正电荷增强了黏膜粘附性和渗透性，改善了与细胞和组织的相互作用。

辣椒素是辣椒的活性成分，因其镇痛和抗炎特性而备受关注，对OA相关疼痛的管理尤为有益。辣椒素选择性结合C型初级传入纤维上表达的香草酸受体亚型TRPV1，导致突触间隙内P物质释放增加。然而，辣椒素尚未被批准作为注射疗法用于深层解剖结构来源的疼痛治疗，其应用受限于水溶性差、不良灼烧感和高首过代谢导致的重复给药需求。这为其制剂开发带来了挑战，需要管理初始急性灼烧感，同时确保足够长的暴露时间以达到适当的局部镇痛效果。

本研究旨在开发一种新型TMC水凝胶系统，专门用于OA治疗中辣椒素的持续、靶向递送，并假设通过水凝胶递送实现辣椒素的持续释放可能影响巨噬细胞极化和血管生成，从而有助于减缓OA进展。

二、主要研究内容与结论

研究人员开发并评估了一种基于TMC的热响应水凝胶系统，用于关节腔内持续递送辣椒素。体外实验表明，该水凝胶系统提高了辣椒素的生物相容性，使软骨细胞和巨噬细胞可耐受高达250 μM的辣椒素浓度，同时显著抑制了脂多糖（LPS）激活的巨噬细胞向促炎性M1表型的极化，CD86⁺细胞减少25%，CD206⁺细胞增加30%。在单碘乙酸（MIA）诱导的OA大鼠模型中，负载辣椒素的TMC水凝胶治疗组在治疗后4周内表现出持续改善的转棒实验表现，组织病理学评分显著降低（平均2分 vs 未治疗对照组6分），软骨厚度显著优于MIA组。免疫荧光分析显示该治疗显著降低了H型血管标志物（CD31和endomucin）及炎症因子白细胞介素-6（IL-6）的表达，同时增加了软骨保护相关因子Noggin的表达，表明该水凝胶系统可能通过调节血管-成骨耦联和炎症微环境来保护关节组织。

三、关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：其一，TMC的合成与表征，以低分子量壳聚糖（50至190 kDa，来源于甲壳类动物，Sigma-Aldrich，美国）为起始材料，通过N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）、碘化钠和碘甲烷进行季铵化反应合成TMC，并经透析和冻干纯化；其二，温敏水凝胶的配制与优化，采用1% TMC与10% β-甘油磷酸钠（β-GP）的组成，通过旋转流变仪评估其温度依赖性流变学特性，并通过紫外-可见（UV–vis）光谱法测定辣椒素的累积释放曲线；其三，体外细胞相容性评估，以大鼠关节软骨细胞（RACs，提取自3周龄雄性Sprague-Dawley大鼠膝关节软骨）和RAW264.7巨噬细胞（购自美国典型培养物保藏中心）为模型，采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂检测细胞活力；其四，巨噬细胞极化分析，通过免疫荧光（IF）染色检测CD86（M1标志物）和CD206（M2标志物）的表达，并使用QuPath开源软件进行阳性细胞计数；其五，动物实验模型建立与功能评价，采用48只6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠（平均体重250 g，购自Orient Bio，韩国城南），通过双侧膝关节腔内注射0.5 mg/50 μl单碘乙酸（MIA）诱导OA模型，采用转棒实验进行功能评估；其六，组织学分析，包括苏木精-伊红（H&E）染色和番红O-固绿（Safranin-O fast green）染色评估软骨完整性，采用国际骨关节炎研究学会（OARSI）组织病理学评分系统进行分级，并使用FIJI软件测量软骨厚度；其七，免疫荧光检测血管生成和炎症标志物，包括CD31、endomucin（H型血管标志物）、Noggin和IL-6的表达分析。

四、研究结果

水凝胶优化、细胞毒性与巨噬细胞极化

细胞活力实验显示，大鼠关节软骨细胞（RACs）可耐受最高250 μM辣椒素，巨噬细胞可耐受最高125 μM辣椒素。500 μM和1000 μM浓度导致显著的细胞活力下降，不适合生物应用。二甲基亚砜（DMSO）浓度高于10%会严重阻碍TMC水凝胶在37 °C下形成稳定凝胶，而低于2.5%时与对照TMC水凝胶的凝胶化能力相似。流变学测量证实添加DMSO和辣椒素未改变温度对凝胶能力的影响。累积释放曲线显示，负载500 μM辣椒素的TMC水凝胶在24 h内释放超过50%，并在72 h达到峰值；50 μM和250 μM制剂表现出相似的释放动力学，但较低负载浓度在观察期结束时表现出18%更高的累积释放。将辣椒素纳入TMC水凝胶显著改善了其细胞相容性，250 μM浓度的TMC水凝胶对RACs和巨噬细胞均维持了高于80%的活力。免疫荧光染色和QuPath定量分析表明，辣椒素和TMC水凝胶+250 μM辣椒素处理均显著降低了CD86表达细胞，而TMC水凝胶单独处理未显著降低CD86表达。所有处理组均表现出CD206阳性细胞的显著增加。

OA动物模型建立与功能测试

双侧关节腔内注射MIA后2周，大鼠转棒潜伏期出现明显下降，并在后续观察期逐渐恶化。组织学图像显示关节软骨层在14天内出现显著侵蚀，软骨厚度在14天时持续下降，与转棒表现下降一致。基于此，将MIA注射后2周确定为治疗干预点，这与大多数OA在出现症状性疼痛时才被诊断的临床情况相符。

治疗后关节功能与宏观完整性

转棒实验显示，所有MIA注射动物在OA诱导后2周均表现出性能下降，该趋势持续至治疗后1周。治疗后3周，所有治疗组相对MIA组均有边际改善。治疗后4周，TMC水凝胶+辣椒素组和辣椒素组表现出一致的更长潜伏期，而其他组性能下降。宏观成像显示，辣椒素主要促进广泛的纤维组织形成；TMC水凝胶+辣椒素在治疗后4周的表现优于其他治疗组；但从软骨保存角度看，PN处理组的退化程度低于其他组。

组织学分析

H&E和番红O-固绿染色显示，未治疗的MIA诱导OA表现为软骨层软骨细胞聚集和血管化 pockets 的形成。辣椒素治疗减少了软骨细胞聚集但出现肥大软骨细胞，仍可见血管形成。TMC水凝胶和PN治疗在增厚的软骨区域内表现出显著的细胞性。TMC水凝胶+辣椒素关节腔内注射减轻了血管形成并减少了软骨细胞聚集，且软骨下骨区域无肥大软骨细胞。治疗后4周，MIA组和辣椒素组表现出显著损伤和广泛纤维组织形成；TMC水凝胶治疗导致软骨区域增厚伴软骨细胞聚集和肥大软骨细胞；TMC水凝胶+辣椒素效果类似但软骨细胞聚集较少。OARSI组织病理学评分显示，治疗后4周MIA组评分显著高于TMC水凝胶、TMC水凝胶+辣椒素和PN治疗组。软骨厚度测量进一步证实，TMC水凝胶单独和TMC水凝胶+辣椒素组均显著优于MIA组，且TMC水凝胶+辣椒素组倾向于表现出比TMC水凝胶单独组更大的软骨厚度。

血管生成与成骨观察

免疫荧光染色显示，MIA注射关节组织中CD31和endomucin（H型血管标志物）表达增加，表明软骨下骨组织内血管发育异常。与MIA相比，大多数治疗组CD31表达显著降低，但TMC水凝胶组除外。仅TMC水凝胶+辣椒素有效降低了endomucin表达，表明软骨下骨血管生成减少。相关分析显示这些生物标志物与转棒潜伏期呈强至中度负相关，表明H型血管的存在可对OA膝关节的功能表现产生负面影响。Noggin表达在辣椒素、TMC水凝胶和TMC水凝胶+辣椒素治疗组中均较MIA组显著增加，提示对软骨完整性具有保护作用。IL-6表达在MIA组中较健康对照组升高；在各项治疗中，仅TMC水凝胶+辣椒素有效降低了IL-6水平，凸显其抗炎作用。

五、讨论与结论

本研究表明，TMC水凝胶不仅作为辣椒素的递送载体，其本身也与有利于软骨组织保存的抗炎微环境相关。游离辣椒素治疗组在转棒实验上表现出显著功能改善但未能保护软骨组织基质，这一发现可归因于未封装辣椒素的快速清除和短暂关节腔滞留——虽然瞬时脱敏提供了疼痛缓解，但其存留时间不足以对抗导致组织退化的分解代谢级联反应，且快速疼痛缓解可能导致动物对受损关节施加破坏性机械应力，加速磨损。TMC水凝胶+辣椒素治疗与血管和成骨标志物表达的变化相关，提示其对OA病理中骨-软骨串扰的可能影响——CD31和endomucin表达的降低以及Noggin表达的增加，表明可能破坏了OA进展中典型的血管生成-成骨耦联。该研究受限于观察时长，需要进一步实验确定更高剂量在OA后期阶段的效果、重复给药以及单次和多次给药的长期应用。鉴于辣椒素是已知的TRPV1激动剂，本研究未包含下游信号阻断剂，因此不能完全排除TRPV1非依赖通路或与阳离子TMC基质的串扰。该治疗策略在此临床前模型中展现出令人鼓舞的结果，在获得额外的机制验证和长期安全性研究后，可能值得作为当前关节腔内症状性OA治疗手段的潜在替代方案进行进一步研究。