三七源性碳量子点（PN-CDs）作为脑缺血再灌注损伤治疗的新型给药策略：抑制炎症、凋亡与氧化应激

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Panax notoginseng-Derived Carbon Quantum Dots as a Novel Administration Strategy for Cerebral Ischemia–Reperfusion Injury Therapy

该研究旨在合成三七（Panax notoginseng）源性碳量子点（Panax notoginseng-derived carbon quantum dots, PN-CDs），并探讨其在脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia–reperfusion injury, CIRI）中的作用。研究人员采用水热法合成PN-CDs，并评估其表征及生物相容性。随后，利用SH-SY5Y细胞和经氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）处理的原代神经元，以及大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R）大鼠建立CIRI模型。PN-CDs处理后，采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR）、流式细胞术、蛋白免疫印迹（Western blot）及2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA）探针检测神经元细胞和大鼠中的炎症、凋亡及氧化应激。同时，采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC）、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL）、尼氏（Nissl）及苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色评估大鼠病理损伤。此外，研究人员给予CIRI大鼠PN-CDs、三七总皂苷（Panax notoginseng saponins, PNS）、三七（Panax notoginseng, PN）或依达拉奉，以探讨PN-CDs是否具有最佳效应。结果显示，PN-CDs具有良好的生物相容性并可穿过血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）。体外，PN-CDs处理抑制氧化应激、凋亡和炎症，表现为白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、IL-6、Bax、C-caspase-3、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）和活性氧（reactive oxygen species, ROS）降低，以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、Bcl-2和谷胱甘肽（glutathione, GSH）升高。在CIRI大鼠中，PN-CDs改善病理损伤并抑制炎症、凋亡和氧化应激。PN-CDs对CIRI的治疗效果明显优于PNS和PN，并与一线药物依达拉奉相当。总之，PN-CDs作为一种新型高效给药策略，通过抑制凋亡、氧化应激和炎症减轻CIRI。

缺血性卒中约占全部卒中的80%，由脑血管闭塞或破裂导致局灶或全脑组织损伤。恢复血流是主要治疗方向，但再灌注本身可诱发CIRI；rtPA（重组组织型纤溶酶原激活剂）是已获批用于缺血性卒中的药物，但治疗时间窗严格（4.5 h），且溶栓恢复血流过程中常诱发CIRI。现有神经保护剂虽在临床前动物模型中显示疗效，却因血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）穿透不足、生物利用度低及明显全身不良反应而难以临床转化。CIRI机制复杂，涉及炎症、凋亡、氧化应激和离子失衡。三七（Panax notoginseng, PN）具止血、抗炎、扩张血管及活血化瘀等药理作用；三七总皂苷（Panax notoginseng saponins, PNS）为其活性成分，已被报道可抑制CIRI中的铁死亡、炎症和氧化应激，并经PINK1/Parkin通路促进线粒体自噬、抑制NLRP3炎症小体，但PN和PNS因分子量大、水溶性差而生物利用度低。碳量子点（carbon quantum dots, CQDs）是直径小于10 nm、由碳核和表面钝化层组成的零维碳纳米材料，具荧光、易制备、良好生物相容性、小尺寸、低毒性和水溶性；其表面含氧官能团及sp²碳域赋予类酶催化和ROS清除潜力。天然药物来源CQDs已用于生物成像、重金属离子检测和光催化等，并因其绿色合成、低成本及ROS清除能力受到关注；已有炭药来源CQDs和栀子来源CQDs在CIRI中显示抗炎、抗氧化及减轻病理损伤的作用。基于此，研究人员以PN为天然药物前体合成PN-CDs，并探讨其对CIRI的作用。

研究人员采用水热法合成PN-CDs，进行表征及生物相容性评价；建立SH-SY5Y细胞和原代神经元OGD/R模型及大鼠MCAO/R模型，检测炎症、凋亡、氧化应激及病理损伤，并将PN-CDs与PNS、PN及依达拉奉比较。结果显示PN-CDs生物相容性良好、可穿过BBB，能抑制炎症、凋亡和氧化应激，改善CIRI大鼠病理损伤；其疗效明显优于PNS和PN，与一线药物依达拉奉相当。该研究为CIRI提供了新型高效给药策略，并提示天然CQDs作为神经保护剂的转化潜力。

关键技术方法包括水热法合成PN-CDs并表征；以SH-SY5Y（中国科学院细胞库）和E18 SD大鼠原代神经元建立OGD/R模型，以雄性8周龄SD大鼠（济南朋悦实验动物繁育有限公司）建立MCAO/R模型，并以大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞构建体外BBB模型；采用细胞活力、细胞死亡、溶血、血生化及组织学染色评价生物相容性；采用免疫测定、基因表达、蛋白检测、流式细胞术、荧光探针及氧化应激指标检测炎症、凋亡和氧化应激；采用神经功能评分、梗死染色、凋亡染色、尼氏染色和组织学染色评价病理损伤。

研究结果如下。

PN-CDs的合成与表征：研究人员以水热法由PN合成PN-CDs；TEM和AFM显示其为均匀分散的球形纳米颗粒，平均直径2.32 ± 0.47 nm，晶格条纹间距0.21 nm，厚度约2.5 nm；XRD、Raman（I_D/I_G=0.82）、UV–Vis、XPS及FTIR证实其具有部分石墨化/无序碳结构，含C=C、C–N、C=O、C–O和O–H等官能团，并含吡啶型N、吡咯型N和石墨型N；Zeta电位为?13.39 ± 0.34；激发/发射波长为439/521 nm，绝对量子产率为7.83%。

PN-CDs的生物相容性：细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）显示，0–1000 μg/ml PN-CDs下原代神经元和SH-SY5Y存活率均>80%；钙黄绿素-AM/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）染色显示80、320和640 μg/ml时活细胞数与对照相似，640 μg/ml仅见少量死细胞；10–1000 μg/ml PN-CDs溶血率低于5%；体外BBB模型第5天跨内皮电阻>200 Ω·cm²，PN-CDs跨BBB能力较PN呈浓度和时间依赖性增强；血生化指标ALT、AST、BUN、DBIL、TBIL、UA、ALP和LDH1无显著变化，H&E示肾、肺、肝、心、脾无损伤。

PN-CDs抑制OGD/R诱导的神经元细胞炎症：OGD/R处理显著升高原代神经元和SH-SY5Y中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，PN-CDs可逆转上述变化；ELISA、qRT-PCR和Western blot均显示PN-CDs降低OGD/R诱导的炎症因子表达。

PN-CDs抑制OGD/R诱导的神经元细胞凋亡：流式细胞术显示OGD/R促进神经元细胞凋亡，PN-CDs减轻该凋亡；Western blot显示PN-CDs剂量依赖性逆转OGD/R导致的Bcl-2降低及Bax、C-caspase-3升高。

PN-CDs减轻OGD/R诱导的神经元细胞氧化应激：DCFH-DA探针显示OGD/R诱导的ROS荧光强度升高可被PN-CDs逆转；OGD/R使GSH和SOD降低、MDA升高，PN-CDs抑制上述改变。

PN-CDs减轻CIRI大鼠的病理损伤：MCAO/R大鼠神经功能评分高于假手术组，PN-CDs降低该评分；TTC显示PN-CDs减少脑梗死面积；H&E和Nissl染色显示PN-CDs改善脑组织结构损伤及尼氏体减少；TUNEL显示PN-CDs逆转CIRI诱导的脑组织凋亡增加。

PN-CDs抑制CIRI大鼠的炎症、凋亡与氧化应激：CIRI大鼠脑组织中IL-6、IL-1β和TNF-α升高，PN-CDs有效降低；Western blot显示CIRI使Bcl-2降低、C-caspase-3和Bax升高，PN-CDs逆转上述变化；PN-CDs还逆转CIRI所致GSH、SOD降低和MDA升高。

PN-CDs对CIRI大鼠的改善作用明显优于PN和PNS：CIRI大鼠分别给予PN-CDs（300 mg/kg/d）、PNS（120 mg/kg/d）、PN（300 mg/kg/d）或依达拉奉（6 mg/kg/d）7 d。PN-CDs组神经功能评分低于PNS和PN组、与依达拉奉组相似；脑梗死体积较PNS和PN组明显减小、与依达拉奉组无显著差异；H&E示PN-CDs组脑组织结构更完整有序，Nissl体增多、TUNEL阳性细胞减少，效果与依达拉奉相近；PN-CDs较PNS和PN明显下调IL-6、IL-1β、TNF-α、Bax、C-caspase-3和MDA，上调Bcl-2、SOD和GSH，其抗炎和抗氧化应激作用与依达拉奉相似。总之，PN-CDs对CIRI大鼠的治疗效果明显优于PNS和PN，并与一线药物依达拉奉相当。

讨论部分指出，CIRI治疗药物受BBB通透性、生物利用度和全身不良反应限制，CQDs作为纳米载体具潜力；PN-CDs跨BBB能力优于PN，但具体机制尚未阐明。炎症、凋亡和氧化应激是CIRI的重要病理环节且相互级联放大；PN-CDs降低TNF-α、IL-6、IL-1β，逆转Bax和C-caspase-3升高及Bcl-2降低，降低ROS和MDA并升高GSH和SOD。作者提出PN-CDs可能通过阻断氧化应激进而抑制炎症和凋亡；并根据XPS所示吡咯型N/吡啶型N比例较高及其与石墨型N的协同，推测其抗氧化能力与N构型有关。与PNS、PN及依达拉奉比较显示PN-CDs疗效优于PNS和PN，与依达拉奉相当。局限性包括：PN-CDs分子机制未明，尚不能区分其通过清除ROS还是激活内源性抗氧化酶发挥作用；仅与依达拉奉比较，未与丁苯酞和rtPA比较；PN临床常需长期给药，PN-CDs长期安全性和疗效持久性仍需更长周期实验验证。

研究结论（译文）：该研究系统探讨了PN-CDs对CIRI的保护作用。作为一种新型高效的给药策略，PN-CDs通过抑制炎症、凋亡和氧化应激减轻CIRI。研究结果表明，PN-CDs作为CIRI治疗的有效神经保护剂具有巨大潜力，为开发基于天然CQDs的缺血性卒中治疗提供了新见解。