《Fishes》：Reproductive Dynamics and Phenotypic Differentiation of Chub (Squalius cephalus) Across a Hydropower Barrier
河流片段化可破坏鱼类迁移并改变局部环境条件，进而可能影响其繁殖与表型发育。本研究考察了被一座无过鱼设施的水电站坝体分隔的河段中欧鲌（Squalius cephalus）的繁殖动态、鳞片与星耳石（asteriscus）形态以及耳石双侧不对称性。繁殖动态以性腺成熟系数（gonadosomatic index, GSI）评估，鳞片与星耳石形态采用几何形态测量学（geometric morphometrics）分析，双侧不对称性则基于成对星耳石的长度、宽度与质量进行评价。GSI随坝体位置、采样日期及其交互作用呈现显著差异，提示坝上、坝下种群性腺发育的时间格局不同。成对几何形态测量分析表明，鳞片与星耳石形态均存在与采样点相关的差异，但各成对比较及分析方法间差异的强度与格局并不一致。相比之下，星耳石波动性不对称（fluctuating asymmetry, FA）未呈现一致的坝上—坝下格局：长度与质量不对称性在各采样点间无显著差异，而宽度不对称性的总体差异未得到校正后成对比较的支持。总体而言，研究结果提示S. cephalus在繁殖动态及鳞片与星耳石形态上存在位点相关差异，而星耳石FA与坝体位置之间未呈现一致格局。
一、研究背景与科学问题
河流筑坝与水利屏障破坏了河流的纵向连续性，直接阻碍鱼类洄游，并引发水位与温度波动加剧、上游河段趋于静水化等一系列复杂变化。上游静水环境改变了水生生态系统的动植物组成，可能导致喜流性鱼类丧失，群落向喜静水类型演替；坝下河段虽基本保持流水特征，但常遭受流量快速波动、流速降低甚至局部断流等干扰。洄游路线丧失与适宜产卵栖息地缺乏可导致物种减少、种群隔离及多种鱼类丰度下降。此外，坝上坝下热力格局的改变可能移动产卵信号与时机，导致同种鱼类不同种群间繁殖异步化，并可能影响鱼类的双侧对称性、耳石生长与鳞片发育。
耳石与鳞片是解析鱼类生活史、年龄结构、洄游格局及环境暴露史的有效工具，可记录日、季或年尺度的环境历史，并作为栖息地利用、洄游格局、出生地、空间分布、种群结构与生活史事件的自然示踪物。硬骨鱼类拥有三类耳石——矢耳石（sagittae）、星耳石（lapilli）与星状耳石（asterisci），分别位于内耳的球囊、椭圆囊与瓶状囊中。耳石与鳞片形态已被广泛用于区分属、种及局域种群内的不同表型群体。耳石形态具有种特异性，受外部因素（水温、盐度）与内部因素（体躯与耳石生长速率）共同决定，并可能受深度与食物等属性影响。耳石与鳞片形态变异亦可反映遗传差异与生理适应，因而为评估栖息于对比环境条件下鱼类的位点相关变异提供了有用的表型标记。
波动性不对称（fluctuating asymmetry, FA）指双侧性状偏离完全对称的微小随机偏差，通常被解读为发育不稳定性的指标。当自然或人为环境胁迫干扰正常发育时，此类偏差可能出现，因此FA被广泛用作鱼类环境胁迫的潜在生物标志物。
欧鲌（Squalius cephalus）是欧洲广泛分布的喜石、喜流性物种，几乎见于所有河流区带以及植被丰富的缓流或静水水域。该物种以机会主义取食著称，食谱多样，偏好浅水砾石底质产卵。作为河游性（potamodromous）物种，S. cephalus会溯河进入小溪产卵，因此水利屏障可能破坏其自然繁殖行为。
研究人员据此假设：被水电站坝体分隔的上下游河段中，S. cephalus在繁殖动态、鳞片与星耳石形态以及耳石不对称性方面存在差异，并与上下游对比鲜明的栖息地条件相关。研究旨在：（1）调查繁殖期性腺发育的时间格局差异；（2）分析耳石与鳞片形态；（3）评估坝上、坝下S. cephalus种群的耳石波动性不对称。
二、研究设计与关键方法
研究于2024年在克罗地亚大陆区的Sunja河开展。该河属于黑海流域，被多座无过鱼设施的堰坝分割。采样设三个位点：Klipi?（KL，坝下，与Sava河连通，保持流水特征）、Mlin（ML，坝上库区）与Staza（ST，ML上游约1 km处，其间有旧水磨坊残坝构成部分迁移屏障）。鱼类样本通过电捕法（EL 63 II，Hans Grassl GmbH，符合HRN EN 14011:2005）与休闲垂钓采集，共获得105尾个体（ML 41尾、ST 48尾、KL 16尾），其中21尾为幼鱼、18尾性别未定。采样时原位测量水温。样本冷冻保存后，测量全长（TL, cm）与体重（W, g），摘取性腺称重并保存于酒精中以备性腺成熟系数（gonadosomatic index, GSI）分析；取右侧背鳍下方鳞片干燥保存；提取左右两侧星耳石（asteriscus，S. cephalus中最大且最坚固的耳石）并清洁标记。
繁殖动态方面，剔除幼鱼与性别未定个体后，分别按性别计算GSI = 100 × (Wg/W)。采用Shapiro–Wilk检验正态性、Levene检验方差齐性，Mann–Whitney U检验比较性别间GSI差异。以坝体位置（上游ST+ML与下游KL）、采样日期及其交互作用为因子，对log10转换后的GSI进行一般线性模型（General Linear Model, GLM）分析，限于两个共同采样日期（3月26日与4月30日）。
形态分析方面，使用右侧星耳石与右侧鳞片进行几何形态测量。在体视显微镜下拍照，利用tpsUtil构建.tps文件，在鳞片上标记7个形态 landmarks（landmark，地标点），在星耳石上标记6个landmarks及17个辅助点，使用tpsDig2获取坐标。通过广义Procrustes分析（generalized Procrustes analysis, GPA）去除非形态信息，获得Procrustes坐标与质心大小（centroid size）。以采样点为分组变量，对Procrustes坐标关于log转换质心大小进行合并组内多元回归以评估异速生长效应。Procrustes ANOVA检验采样点间整体形态差异，典型变量分析（canonical variate analysis, CVA）与判别函数分析（discriminant function analysis, DFA）结合置换检验（10,000次）评估成对差异，DFA交叉验证评估分类可靠性。
波动性不对称分析方面，基于左右星耳石照片测量长度与宽度（ToupView软件，以10 mm参考尺校准），使用分析天平（精度0.001 g）分别称量左右耳石质量。方向性不对称以右减左差值（R ? L）评估，正态分布差值用配对t检验、非正态用Wilcoxon符号秩检验，Holm法校正p值。FA以变异系数CV2a（长度与宽度）及个体FA指数FAi = ∣R ? L∣/[(R + L)/2]计算；质量不对称按Jawad等公式以左右质量差绝对值除以均值表示。个体FA值在采样点间用Kruskal–Wallis检验，显著时以Dunn多重比较加Holm校正。
三、研究结果
3.1 繁殖差异
繁殖样本的性别组成在位点与日期间存在差异：ST共23雄16雌，ML共10雄5雌，KL共10雄2雌。性别间GSI总体比较不显著（Mann–Whitney U检验，p = 0.333），但鉴于性别比例不均且雌鱼数量少，该结果不应被解读为两性等价，后续分析合并性别以维持足够样本量。上游种群GSI从3月初上升，3月26日达高值（3.99 ± 0.60），4月19日下降（2.35 ± 0.68），4月30日再次上升（4.66 ± 0.79）；下游种群3月26日GSI同样较高（4.37 ± 1.29），但4月30日大幅降低（0.91 ± 0.18）。研究期间水温上游9.2–17.2 °C、下游9.5–16.5 °C，两河段高GSI均出现在3月底约9.5–9.7 °C时。GLM分析显示坝体位置（F1,27 = 16.02, p < 0.001）、采样日期（F1,27 = 6.36, p = 0.0179）及其交互作用（F1,27 = 11.87, p = 0.0019）均显著，表明坝上、坝下种群性腺发育的时间格局不同。
3.2 耳石与鳞片形态
几何形态测量初始纳入66尾个体，去除离群值后，鳞片分析最终数据集为64尾（ML = 12, KL = 11, ST = 41），星耳石分析为60尾（ML = 11, KL = 13, ST = 36）。Procrustes ANOVA显示星耳石形态在采样点间差异显著（F = 2.14, p < 0.0001; Pillai trace = 1.71, p = 0.0031）；鳞片形态的F检验不显著（F = 1.43, p = 0.0995），但Pillai trace显示显著多元效应（Pillai trace = 0.61, p = 0.0031）。鳞片形态与质心大小间无异速生长关系（质心大小解释2.06%形态变异，p = 0.2523），故后续使用原始Procrustes坐标；星耳石存在显著异速生长关系（log质心大小解释4.67%形态变异，p = 0.0062），后续使用回归残差。
成对DFA置换检验（基于Procrustes距离）显示，鳞片形态在KL与ML间（p = 0.0060）及KL与ST间（p = 0.0010）差异显著，ML与ST间不显著（p = 0.5060）；基于T-square（Mahalanobis距离）的检验仅支持KL与ST间显著判别（p < 0.0001）。交叉验证分类成功率以KL–ST最高（86.5%），ML–ST为56.6%，KL–ML为52.2%。星耳石形态方面，基于Procrustes距离的成对检验显示KL与ML间（p = 0.0086）及ML与ST间（p = 0.0257）差异显著，KL与ST间不显著（p = 0.0608）；基于T-square的检验仅支持KL与ST间显著判别（p = 0.0287）。交叉验证分类成功率以KL–ST最高（69.4%），KL–ML为54.2%，ML–ST为42.6%。
CVA排序显示，鳞片形态沿第一典型变量（CV1）分离最清晰：KL个体鳞片外露后部相对更细长且规则，ML与ST个体鳞片更宽、更呈菱形，自前部嵌入基部向外缘加宽；CV2变异主要与鳞片前部嵌入部分的相对范围与构型有关。星耳石形态CVA显示ST沿CV1与KL、ML分离，CV2进一步区分KL与ML；线框变形图显示形态变异主要集中于星耳石前部与前腹侧区域，尤其前缘及相邻切迹附近，后部轮廓相对稳定。
3.3 星耳石波动性不对称
FA分析纳入ML 12尾、ST 30尾、KL 13尾的成对左右耳石。各采样点耳石长度均未检测到方向性不对称（p > 0.05）；耳石宽度在KL与ST两侧无显著差异，ML右侧耳石较宽（W = 10.0, p = 0.020），但Holm校正后不再显著（padj = 0.060）；右侧耳石在各采样点均倾向于更重，KL与ML为临界校正结果，ST仍显著（W = 30.5, p = 0.016, padj = 0.049）。然而，由于平均左右质量差小于分析天平0.001 g的分辨率，表观质量不对称可能部分反映测量精度而非生物学意义上的侧别差异。
位点特异性FA结果显示，KL（坝下）耳石长度与宽度的CV2a值均最低（分别为2.279与2.645），长度CV2a最高值出现在ML（3.751），宽度最高值出现在ST（3.049）；平均耳石质量不对称以ML最高（0.144）、ST最低（0.116）。个体FA值在采样点间的比较显示，耳石长度不对称（Kruskal–Wallis, H = 4.225, p = 0.121）与质量不对称（H = 0.493, p = 0.781）均无显著差异；耳石宽度不对称在采样点间差异显著（H = 6.242, p = 0.044），但Dunn事后成对比较均不显著（p > 0.05）。
四、讨论与结论
总体而言，坝上、坝下S. cephalus在性腺发育时间格局及鳞片与星耳石形态上存在差异，这与河流调控可改变繁殖动态、耳石与鳞片形态在流水与静水栖息地间存在变异的既有证据一致。FA则未呈现一致的坝体相关格局，但不对称性未升高并不排除环境胁迫的存在，这与鱼类FA反应具有胁迫特异性、未必能作为环境退化统一指标的先前发现相符。
本研究中性腺发育至高级阶段约在10 °C时发生，提示产卵可能在该温度左右启动，处于文献报道温度范围的低端。文献中产卵一般在水温升至12 °C以上时开始，但保加利亚有在4月约8 °C平均水温下产卵的报道，土耳其则在3–4月于13.5–20.6 °C水温下产卵。产卵季节雄性占优的现象亦见于Squalius squalus，与本研究观察到的性别比例一致。
观测到的GSI格局提示，坝下河段的第一次产卵事件可能更早完成。两河段3月在约9.5–9.7 °C时均呈高GSI，但4月底流水河段GSI显著下降而坝上静水河段再次上升，表明被坝体分隔的鱼类繁殖发育时间格局不同。此类差异可能反映前期热条件及其他已知影响性腺成熟与产卵的环境线索（温度、流量、光周期、适宜产卵栖息地可获得性）的差异。河流调控可能进一步改变与鱼类繁殖相关的短期热线索与累积温度条件，但本研究未直接评估这些潜在机制。此外，GSI仅提供繁殖状态的间接度量，无法可靠确定精确繁殖阶段或产卵时间，确认需通过性腺成熟度分期（最好辅以组织学检查）或其他直接产卵证据。样本性别组成不均、尤其KL雌鱼数量少，限制了性别比较的统计功效，性别组成变异也可能对观测到的GSI格局有所贡献。
GSI差异亦可能与产卵栖息地的可达性与物理特征有关。S. cephalus进行产卵洄游，可能迁移数公里到达适宜产卵场而非使用最近地点，部分个体在一个繁殖季节可能使用多个产卵区域，个别情况下甚至向下游迁移产卵。产卵位点通常具有约0.4 m s?1的低流速、0.1–1.2 m水深与石质底质。Sunja河水电站坝体完全阻止KL与上游位点间的移动，旧磨坊结构可能进一步限制ML与ST间的移动。此外，坝下河段受水电站泄流影响，可能维持较粗的砾石主导底质，而坝上河段以细颗粒沉积物沉积为特征。此类片段化与栖息地改造可能限制适宜产卵场的可达性并改变繁殖活跃鱼类的空间分布。已有研究亦表明S. cephalus产卵区域与早期生活史迁移格局存在显著变异性，强调纵向连通性对维持替代繁殖栖息地可达性的重要性。但本研究的局限在于坝下鱼类仅在两个日期采样，需在繁殖季前、中、后更频繁均衡的采样以确认观测格局。
鳞片形态方面，KL个体鳞片外露后部更细长规则，ML与ST个体鳞片更宽更菱形，前部嵌入部分亦有变异。既往几何形态测量研究已显示鱼类鳞片前部嵌入部分存在种群相关变异，包括相对宽度在种群与栖息地间的差异。此类变异可能反映栖息地相关的表型可塑性，但种群占据地理或环境相似栖息地时判别力可能较弱。几何形态测量变异本身不能解读为鳞片嵌入更深或更牢固的证据，需直接解剖评估鳞片在真皮鳞囊中的位置与附着。
星耳石形态方面，CVA排序显示ST与KL、ML沿CV1分离，KL与ML沿CV2进一步分化，形态变化集中于前部与前腹侧区域，后部轮廓相对稳定。类似的内耳瓶状囊与椭圆囊耳石形态种群相关变异已在不同内陆水域的S. cephalus中报道，支持耳石形态作为种群分化表型标记的用途。但成对分化强度在不同分析方法间不完全一致：基于Procrustes距离的检验支持KL–ML与ML–ST差异，基于T-square的检验仅支持KL–ST差异，后者交叉验证分类成功率亦最高。Procrustes距离量化平均形态差异的大小，而Mahalanobis距离与T-square评估相对于组内变异与协方差结构的组间分离，故不同检验未提供完全一致的显著性格局属预期现象。ML与ST间缺乏一致分化可能反映其部分连通性（洪水期旧磨坊屏障可通行）。本研究未调查采样点间的遗传分化，观测到的鳞片与耳石形态差异不能具体归因于坝体导致的种群隔离，可能反映环境诱导的表型可塑性、个体生长史或栖息地条件差异、基因流受限导致的遗传分化，或上述因素的组合，因为耳石及其他形态性状可能同时受环境与遗传过程影响。未来研究应纳入遗传分析以确定坝体是否促成种群遗传结构化。
星耳石FA未呈现与坝体位置一致的模式，仅显示适度的位点相关变异而非清晰的上下游响应，与鱼类FA反应可能因性状与胁迫类型而异、不应被解读为环境退化通用指标的既有证据一致。耳石FA结果、尤其基于质量的FA应谨慎解读，因为平均左右质量差小于分析天平0.001 g分辨率，可能部分反映测量误差而非真实生物学不对称。此外，耳石不对称可能受碳酸钙多晶型组成等内在特征影响，可独立于环境胁迫而显著影响表观双侧差异。因此观测到的变异应视为初步结果，需更大规模均衡样本、重复测量及更高耳石质量测定精度以评估河流片段化相关栖息地改造是否促成发育不稳定性。
结论：总体结果表明S. cephalus在繁殖动态及鳞片与星耳石形态上存在位点相关差异，但形态测量分化的强度与格局并非在所有成对比较或分析方法间一致。相比之下，星耳石波动性不对称与坝体位置之间未呈现一致格局。维持或恢复纵向连通性（包括提供有效过鱼设施）可能有助于鱼类进入产卵栖息地并在河段间移动。未来需基于更均衡的季节性采样、性腺组织学、详细栖息地测量、更精确且重复的耳石测量以及补充遗传或微化学分析的研究，以阐明观测格局背后的机制。
