《Fishes》：Comparative Analysis of Gonadal Transcriptome Profiles in Neptunea arthritica cumingii with Different Shell Colors
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香螺（Neptunea arthritica cumingii）是中国北方重要的经济性大型海洋腹足类动物，然而过度捕捞已导致其商业资源急剧减少。本研究调查了三种不同壳色（红褐色HZ、黄褐色HH和白色BS）的雌性香螺的繁殖力差异及性腺基因表达谱。各组间记录到显著
香螺（Neptunea arthritica cumingii）是中国北方重要的经济性大型海洋腹足类动物，然而过度捕捞已导致其商业资源急剧减少。本研究调查了三种不同壳色（红褐色HZ、黄褐色HH和白色BS）的雌性香螺的繁殖力差异及性腺基因表达谱。各组间记录到显著的繁殖力差异，其中BS组表现出明显高于其他组的繁殖力。转录组学分析显示各组性腺基因表达存在显著差异（共9个RNA-seq样本，每组3个生物学重复）；在HZ vs. BS、HH vs. BS和HZ vs. HH比较组中分别鉴定出11,702、14,731和15,706个差异表达基因（DEGs）。GO和KEGG富集分析表明DEGs参与多种生物学过程。值得注意的是，部分DEGs显著富集于繁殖和发育相关通路，包括雌激素信号通路、卵巢类固醇生成和卵母细胞减数分裂。研究鉴定了与繁殖力相关的候选基因，包括Vtg、Foxl2、17β-HSDs、SOX9和Dmrt1。这些基因在BS组的表达水平显著上调，表明它们可能参与雌性性腺发育和卵子发生过程。此外，通过qRT-PCR验证了基因表达模式。本研究为香螺繁殖力相关性状的未来研究奠定了基础。
一、研究背景与科学问题
香螺（Neptunea arthritica cumingii）是中国北方沿海地区重要的经济性大型温带肉食性海洋腹足类动物，主要分布于黄海和渤海沿岸（如辽宁和山东）以及朝鲜半岛和日本北海道周边海域。由于其足部肉质丰厚且营养价值高，已成为中国北方沿海地区重要的经济性海洋腹足类。目前，香螺资源主要依赖野生捕捞，但随着市场需求增加，过度捕捞导致自然种群数量急剧下降。因此，需要加强香螺人工繁殖和遗传育种研究，以促进资源恢复和可持续利用。
香螺是雌雄异体物种，繁殖力相对较低，通常每尾雌性通过体内受精和体外孵化仅产生70-90个幼体。这一低繁殖力特性严重制约了其大规模人工养殖的发展。随着高通量测序技术的快速发展，多组学方法已成为揭示水生生物重要经济性状分子机制的有力工具。已有研究表明，在鲤鱼、凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）等多种水生生物中，转录组学分析成功鉴定了与生长、繁殖力、性别分化等性状相关的候选基因。然而，香螺繁殖力性状相关的基因和生物学通路仍缺乏系统研究，这严重阻碍了高繁殖力品系选择育种项目的进展。
值得注意的是，香螺壳呈纺锤形或卵圆形，具有多种壳色类型，包括红褐色（HZ）、黄褐色（HH）和白色（BS）。已有研究表明软体动物壳色与多种性状密切相关，如生长、胁迫耐受性和环境适应性。例如，福寿螺（Pomacea canaliculata）黄色群体的壳高、壳宽等指标显著大于黑色群体；合浦珠母贝（Pinctada fucata）红壳群体对环境盐度变化响应更快；文蛤（Meretrix meretrix）红壳个体的类胡萝卜素含量和总抗氧化能力显著高于白壳个体。此外，在腹足类Littorina fabalis中，壳色频率与性适合度显著相关，呈现负频率依赖选择模式。然而，关于壳色多态性与香螺繁殖力性状之间关系的研究仍然缺乏。
基于上述背景，本研究旨在比较三种不同壳色香螺群体的繁殖力差异，并通过转录组学分析雌性性腺的差异基因表达谱，筛选与繁殖力相关的关键候选基因和分子通路，为香螺高繁殖力品系的人工繁殖和选择育种提供分子基础。
二、研究内容与主要结论
研究人员于2024年3月从大连旅顺沿海采集了三种不同壳色的野生香螺群体，每组随机选取100个健康个体进行实验室饲养。产卵期结束后，每组随机取样30只雌性进行繁殖力指标测量和统计分析。随后对雌性性腺进行转录组测序，通过差异表达基因鉴定、GO和KEGG富集分析筛选繁殖力相关候选基因，并利用qRT-PCR验证转录组数据的可靠性。
研究发现，BS组的性腺重量和卵胶囊数量显著高于其他组（p < 0.05），表明BS组可能具有更高的繁殖潜力。转录组测序共获得3.2868亿条原始读段（49.30 Gb），经质控后保留2.8亿条清洁读段（41.57 Gb）。通过从头组装获得105,699个转录本和76,191个unigenes，平均长度747.14 bp，N50长度为804 bp。差异表达分析在HZ vs. HH、HH vs. BS和HZ vs. BS比较组中分别鉴定出15,706、14,731和11,702个DEGs，其中1,559个DEGs为三组共有。
GO富集分析显示DEGs涉及免疫应答、碳水化合物代谢、脂质代谢、能量代谢、神经调节和信号转导等多种生物学功能。KEGG通路富集分析发现免疫相关通路在多个比较组中显著富集。值得注意的是，部分DEGs显著富集于繁殖和发育相关通路，包括雌激素信号通路（ko04915）、卵巢类固醇生成（ko04913）和卵母细胞减数分裂（ko04114）。
通过严格筛选，研究人员鉴定出15个与繁殖和性腺发育相关的候选基因，包括Vtg、Vasa、IGF1、IGF2BP1、HES1、Dmrt1、DMC1、DLC1、HSP90、SOX9、HOX5、Foxl2、17β-HSD4、17β-HSD10和17β-HSD12。这些基因在BS组的表达水平显著高于其他组。qRT-PCR验证结果显示基因表达模式与RNA-seq数据高度一致，证实了转录组结果的可靠性。
三、关键技术与方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：样本来源于2024年3月采集自大连旅顺沿海的野生香螺群体，每组选取100个健康个体。繁殖力指标包括性腺重量、卵块重量、卵块长度和卵胶囊数量。转录组测序采用Illumina平台，每组设置3个生物学重复，每个重复由3个同壳色个体的性腺组织等量混合。生物信息学分析使用fastp进行数据质控、Trinity进行从头组装、RSEM进行表达定量、DESeq2进行差异表达分析、GOSeq和topGO进行GO富集分析、KOBAS进行KEGG通路富集分析。qRT-PCR以18S rRNA为内参基因，采用2-△△ct方法计算相对表达量。
四、研究结果
4.1 不同壳色群体繁殖力比较
各组间繁殖力相关指标比较显示，HZ和HH雌性之间的性腺重量、卵块重量和卵块长度无显著差异。然而，BS组的性腺重量和卵胶囊数量显著高于其他组（p < 0.05）。BS组卵胶囊数量范围为23-113个，平均71.67个，显著高于HZ组（平均59.63个）和HH组（平均54.75个）。BS组中60-90个卵胶囊范围内的个体比例更高（50.5%）。
4.2 不同壳色群体雌性性腺转录组测序
转录组测序共产生3.2868亿条原始读段（49.30 Gb），平均每样本3,652万条。质控后保留2.8亿条清洁读段（41.57 Gb），Q30值范围为88.67%-91.24%。样本相关性分析显示同壳色样本紧密聚集，组内高Pearson相关系数表明生物学重复性良好。
4.3 性腺转录组组装与功能注释
通过Trinity从头组装获得105,699个转录本和76,191个unigenes，总长度56,925,018 bp，平均长度747.14 bp，N50为804 bp。NR数据库注释率最高，13,656个基因占17.92%。GO注释显示unigenes被分配到2,704个GO条目，其中繁殖（GO:0000003）和生殖过程（GO:0022414）分别包含1,706和1,688个unigenes。KEGG注释显示14,382个基因映射到34个功能通路，信号转导通路包含最多unigenes（2,194个）。
4.4 不同壳色群体雌性性腺差异基因表达分析
HZ vs. HH比较组中7,250个基因上调和8,456个基因下调；HH vs. BS比较组中7,379个上调和7,352个下调；HZ vs. BS比较组中5,237个上调和6,465个下调。共有1,559个DEGs在三个比较组中共享。层次聚类热图显示各组间存在显著差异的表达模式。
4.5 GO和KEGG富集分析
HZ vs. BS组有175个GO条目显著富集，HH vs. BS组有329个，HZ vs. HH组有255个。KEGG富集分析显示免疫相关通路在多个比较组中显著富集，包括溶酶体（ko04142）、IL-17信号通路（ko04657）、NF-kappa B信号通路（ko04064）、TNF信号通路（ko04668）、Toll和Imd信号通路（ko04624）等。此外，雌激素信号通路（ko04915）、卵巢类固醇生成（ko04913）和卵母细胞减数分裂（ko04114）等繁殖相关通路显著富集。
4.6 繁殖力相关候选基因筛选
共鉴定出15个与繁殖和性腺发育相关的DEGs，包括Vtg、Vasa、IGF1、IGF2BP1、HES1、Dmrt1、DMC1、DLC1、HSP90、SOX9、HOX5、Foxl2、17β-HSD4、17β-HSD10和17β-HSD12。这些基因在BS组的表达水平显著高于其他组。qRT-PCR验证了其中10个基因的表达模式与RNA-seq数据高度一致。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究首次比较了不同壳色香螺雌性的繁殖力差异。BS组性腺重量和个体产卵量均显著高于HH和HZ组，表明BS组可能具有更高的繁殖潜力。转录组分析鉴定的15个候选基因中，Vtg作为卵黄蛋白原的主要前体，在BS组表达显著上调，推测其通过介导卵黄物质沉积影响卵巢发育和卵子发生。Foxl2作为叉头框基因家族成员，在BS组表达显著高于其他组，可能参与调控卵巢发育过程。17β-HSDs作为性类固醇激素合成中的关键氧化还原酶，其三个成员（17β-HSD4、17β-HSD10和17β-HSD12）在BS组均显著上调，推测通过参与性类固醇激素合成调控繁殖过程。SOX9和Dmrt1作为性别决定和分化相关基因，在BS组表达相对较高，可能参与调控性腺分化和发育过程。
研究结论：为探究壳色对繁殖力性状的影响并鉴定相关基因和通路，研究人员分析了不同壳色雌性个体的繁殖力差异和性腺基因表达谱。BS个体表现出显著高于其他组的繁殖力水平。转录组学揭示了各组雌性性腺的显著基因表达差异，部分DEGs显著富集于繁殖和发育相关分子通路。鉴定了与繁殖力相关的候选基因，如Vtg、Foxl2、17β-HSDs、SOX9和Dmrt1，这些基因在BS组的表达水平显著高于其他组，表明它们可能参与雌性性腺发育和卵子发生过程。qRT-PCR验证证实了转录组数据的可靠性。本研究鉴定了香螺繁殖力变异相关的候选基因和生物学通路，为未来功能研究和选择育种研究奠定了基础。
