## 中文标题 亚致死浓度吡氟菌酰在斑马鱼（*Danio rerio*）中的生物富集、肠道氧化应激及肠道菌群响应研究

《Fishes》：Effects of Pydiflumetofen on Bioconcentration, Intestinal Oxidative Stress, and Gut Microbiota in Zebrafish (Danio rerio)

　　

吡氟菌酰（Pydiflumetofen）是一种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI）类杀菌剂，常在水环境中被检出，但其对斑马鱼肠道微生态的影响尚不明确。本研究将斑马鱼暴露于7.33和73.3 μg/L吡氟菌酰8 d，评估其对生物富集、氧化应激及肠道菌群的影响。结果显示，生物富集因子（BCF_8d）分别为21.41和18.20 L/kg，表明具有中等生物富集性。肠道氧化还原指标呈现时间和浓度依赖性变化。高浓度暴露与氧化应激增加相关，表现为丙二醛（MDA）升高及超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）水平降低。β-多样性揭示浓度和时间对肠道微生物群落结构具有显著主效应。相对丰度分析提示，低浓度组与高浓度组间假单胞菌门（Pseudomonadota）和浮霉菌门（Planctomycetota）呈相反趋势，而梭杆菌门（Fusobacteriota）和放线菌门（Actinomycetota）呈下降趋势。LEfSe识别出探索性判别类群。然而，经FDR校正后，科水平差异均未保持显著。综上，亚致死性吡氟菌酰暴露与体内蓄积、肠道氧化应激及肠道菌群组成改变相关。上述结果为吡氟菌酰在测试条件下的水生危害表征提供了多层面证据。

## 论文解读

### 研究背景与问题

琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHIs）类杀菌剂通过靶向病原体线粒体呼吸复合体II抑制能量代谢而发挥杀菌活性，具有作用机制新颖、杀菌谱广、内吸性强等优势，在全球农药市场中占据重要地位。然而其广泛使用已导致在地表水和地下水中频繁检出，例如美国地表水中啶酰菌胺（boscalid）最高浓度达2120 ng/L，英国地表水中最高达100 μg/L，表明该类农药可经地表径流和农田排水持续进入水体，对水生生态系统构成潜在威胁。

吡氟菌酰是由先正达开发的新型吡唑酰胺类SDHI杀菌剂，在中国已登记用于小麦、水稻、玉米、油菜、番茄等多种作物。由于其大规模使用，吡氟菌酰可通过地表径流、喷雾飘移和农田排水进入水体，在澳大利亚墨尔本地区地表水样品中检出平均浓度为0.19 μg/L。该化合物在实验室条件下水解稳定，但在稻田水和"水-沉积物"系统水相中消散较快（半衰期分别为0.72–2.47 d和0.74–8.03 d），而在土壤中持久性很强（DT₅₀为654–3210 d），在水-沉积物系统中半衰期为270–299 d，提示其在水生生态系统中持久存在并对水生生物构成持续暴露风险。已有研究表明，吡氟菌酰对虹鳟（*Oncorhynchus mykiss*）、鲤（*Cyprinus carpio*）等不同营养级水生生物具有毒性，96 h LC₅₀为0.18–0.66 mg/L。

在生态毒理学评价中，斑马鱼是常用模式生物。已有研究显示多种SDHI杀菌剂对斑马鱼具有毒性和生物蓄积潜力，例如苯并烯氟菌唑（benzovindiflupyr）96 h LC₅₀为0.066 mg/L，氟吡菌酰胺（fluopyram）呈中等生物富集（BCF为15.22–21.62 L/kg）。吡氟菌酰已被报道可诱导斑马鱼氧化应激、脂质蓄积和细胞凋亡，严重损害胚胎发育，并在鱼体和肌肉组织中检出。然而，这些研究主要依赖单一时间点的终点测定，未能对同一暴露条件下生物富集过程、氧化应激和肠道菌群变化进行整合的动态表征。

肠道菌群作为宿主健康的重要调节者，在维持肠道屏障、调节免疫应答和影响能量代谢方面发挥关键作用。近年来，SDHI杀菌剂对肠道菌群的影响日益受到关注。研究表明，啶酰菌胺暴露可显著增加斑马鱼肠道假单胞菌门和放线菌门相对丰度，降低梭杆菌门和柔膜菌门水平，同时潜在有益菌属*Cetobacterium*减少而病原菌增加；苯醚甲环唑（difenoconazole）暴露亦可改变斑马鱼肠道菌群组成；苯并烯氟菌唑可损伤肠道结构、下调屏障相关基因表达并导致菌群失调。然而，吡氟菌酰对斑马鱼肠道菌群的影响尚未见报道。

基于此，研究人员假设亚致死性吡氟菌酰暴露可导致斑马鱼体内蓄积，并诱导时间和浓度依赖性的肠道氧化应激，伴随肠道菌群组成改变。为此，研究人员开展96 h急性毒性试验确定LC₅₀，并在1/100和1/10 96 h LC₅₀浓度下系统研究生物富集、肠道氧化应激及肠道菌群动态变化，旨在为吡氟菌酰的危害表征提供多层面毒理学数据，并支持其未来的水生生态风险评估。

### 关键技术方法

研究以AB系斑马鱼（购自潍坊京禾生物科技有限公司，体长2.5–3.0 cm）为对象，按OECD 203指南开展96 h急性毒性试验（半静态法，24 h换液）确定LC₅₀；依据GB/T 31270.7-2014开展8 d生物富集试验，设7.33和73.3 μg/L两个亚致死浓度组及对照组，每组3个平行水族箱；于暴露第2天和第8天采集全肠，采用商业试剂盒测定SOD、CAT、GSH和MDA等氧化应激生物标志物；采用HPLC-MS/MS测定水和鱼体中吡氟菌酰浓度并计算BCF；提取肠道微生物基因组DNA，扩增16S rRNA基因V1-V9区，基于PacBio Sequel IIe平台进行全长测序，并结合OTU聚类、α/β多样性分析、PERMANOVA、LEfSe等生物信息学方法分析菌群结构与判别类群。

### 研究结果

**3.1 急性毒性**：暴露12 h首次出现游动减弱和失衡等中毒症状，24 h失衡加重，48 h后存活鱼逐渐恢复，72 h后仅表现为游动迟缓。死亡率随浓度升高而增加，多集中于前48 h。概率单位分析得96 h LC₅₀为0.733 mg/L（95%置信限：0.588–0.901 mg/L）。

**3.2 生物富集因子**：对照组全鱼样品未检出吡氟菌酰。吡氟菌酰在斑马鱼体内快速蓄积，第2天达峰值后趋于平台。低、高浓度组BCF_8d分别为21.41和18.20 L/kg，依据GB/T 31270.7-2014（BCF 10–100 L/kg为中等富集潜力）属中等生物富集。

**3.3 对肠道氧化应激生物标志物的影响**：第2天，低浓度组CAT显著高于对照、高浓度组显著低于对照；两处理组GSH均显著高于对照且高浓度组最高；低浓度组SOD显著高于对照和高浓度组，MDA显著低于对照和高浓度组。第8天，低浓度组CAT、SOD和MDA显著高于对照，GSH无显著变化；高浓度组GSH和SOD显著低于对照，CAT和MDA显著高于对照。随时间推移，低浓度组CAT和SOD显著下降、MDA显著升高；高浓度组GSH和SOD显著下降、CAT和MDA显著升高。浓度×时间交互作用对所有标志物均显著（p < 0.001），表明氧化应激响应兼具浓度和时间依赖性。

**3.4 对肠道菌群的影响**

**3.4.1 α-多样性**：Shannon指数的浓度主效应及浓度×时间交互作用显著，第8天对照与高浓度组间差异显著；Simpson指数仅浓度主效应显著，事后比较未见组间显著差异。总体α-多样性响应相对有限。

**3.4.2 β-多样性**：PCoA中PC1和PC2分别解释36.74%和25.40%的总变异（累积62.14%），NMDS stress值为0.124。双因素PERMANOVA显示浓度（R² = 0.52，F = 12.94，p = 0.001）和时间（R² = 0.20，F = 9.75，p = 0.001）主效应均显著；分时间点单因素PERMANOVA显示第2天（R² = 0.80）和第8天（R² = 0.82）浓度均显著影响群落结构，效应量相近。受平台限制，浓度效应是否随时间变化未能直接检验。

**3.4.3 门水平组成变化**：假单胞菌门为各组优势门（对照组占68.18–80.98%，全部组为59.92–95.52%），低浓度组升高而高浓度组降低，呈双向响应；浮霉菌门呈相反模式；梭杆菌门在所有处理组降幅超过80%；放线菌门和疣微菌门（Verrucomicrobiota）亦下降；芽孢杆菌门（Bacillota）在所有处理组升高且随浓度增加而升高。门水平变化在第2天和第8天趋势一致，呈明显浓度特异性响应。

**3.4.4 科水平组成变化**：经Benjamini–Hochberg FDR校正后，两个时间点均无科水平显著差异（校正p > 0.05），故仅描述相对丰度变化方向。第2天前10位科总相对丰度由对照组41.6%降至低、高浓度组的35.7%和29.7%；已报道含潜在机会性成员的莫拉菌科（Moraxellaceae）在两处理组均较高，肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae）在高浓度组较低；含潜在有益成员的梭杆菌科（Fusobacteriaceae）和乳杆菌科（Lactobacillaceae）在两处理组均较低。第8天前10位科总相对丰度由对照组40.5%降至27.7%和30.4%；假单胞菌科、莫拉菌科和希瓦氏菌科（Shewanellaceae）在两处理组均较高，气单胞菌科（Aeromonadaceae）仅在高浓度组较高；梭杆菌科在两处理组均较低。部分科（如肠杆菌科、副球菌科Paracoccaceae、根瘤菌科Rhizobiaceae）随时间呈不同变化模式，norank_o_Planctomycetales在两个时间点均持续降低。

**3.4.5 LEfSe探索性判别类群分析**：以LDA > 4且p < 0.05为阈值，第2天共识别25个探索性判别类群：对照组富集10个（主要来自肠杆菌目、肠杆菌科、*Plesiomonas*、梭杆菌科谱系至*Cetobacterium*、*Gemmobacter*、*Gellertiella*等）；低浓度组富集2个（*Rhizobium*、*Ciceribacter*）；高浓度组富集13个（多来自浮霉菌门各分类阶元及Gemmataceae、*Gemmata*，另有Roseobacteraceae及*Ketogulonicigenium*）。第8天共识别21个判别类群：对照组富集3个（均为浮霉菌门相关）；低浓度组富集7个（莫拉菌目、莫拉菌科、*Acinetobacter*、假单胞菌目、假单胞菌科、*Pseudomonas*、拟杆菌门Bacteroidota）；高浓度组富集11个（仍以浮霉菌门相关类群为主，并新增目、科、属水平的未分类α-变形菌门类群）。两个时间点间富集特征发生明显更替：对照组由第2天的10个（肠杆菌科、梭杆菌科、副球菌科、根瘤菌科等）变为第8天的3个浮霉菌门相关类群；低浓度组由根瘤菌科相关转为莫拉菌科和假单胞菌科相关；高浓度组始终以浮霉菌门为核心富集谱系。

### 讨论与结论

本研究在同一8 d暴露框架内整合分析了全鱼生物富集、肠道氧化应激指标和肠道菌群，从时间维度系统表征了吡氟菌酰对成年斑马鱼的亚致死效应。研究人员指出，吡氟菌酰在鱼体内快速蓄积，第2天达峰后进入平台期，伴随肠道氧化还原状态动态变化和肠道菌群逐步重塑，将对该化合物的毒理学认识从急性致死效应拓展至体内化学过程、肠道生化响应和微生物生态变化等多个层面。

研究认为，两个亚致死浓度下的BCF_8d（21.41和18.20 L/kg）表明在实验条件下吡氟菌酰存在可测量的生物富集，支持其可在较短的暴露期内达到或接近体内稳态水平，且已有研究报告的BCF值因研究而异。氧化应激响应取决于暴露浓度和时间：低浓度组第2天CAT、GSH和SOD相对对照组升高而MDA降低，提示早期抗氧化防御被激活，第8天MDA升高提示脂质过氧化随暴露延长而加剧；高浓度组呈不同轨迹，第2天CAT和SOD降低而GSH升高，第8天GSH和SOD降低而MDA显著升高，这一模式更符合由早期氧化还原代偿向后期氧化失衡转变的非线性过程，而非简单的单调剂量-效应关系。研究人员指出，线粒体复合体II抑制可破坏电子传递并促进活性氧（ROS）生成，以往多种SDHI杀菌剂的水生生物暴露研究也报道了氧化应激响应，支持线粒体功能扰动作为潜在机制背景。

关于菌群，α-多样性响应有限（Shannon指数受浓度及交互作用影响，第8天对照与高浓度组间有差异；Simpson指数仅受浓度影响），这与既往研究中β-多样性较Shannon指数更敏感的观察基本一致。门水平上，假单胞菌门在低浓度组升高、高浓度组降低，浮霉菌门呈相反趋势，放线菌门和梭杆菌门总体下降；研究人员认为这些变化并非整个群落的单向迁移，而是优势类群间相对平衡的重新分配，且浓度不仅影响变化幅度还可能改变微生物响应方向，与氧化应激标志物的非线性响应相一致。科水平上，第2天和第8天前10位优势科总相对丰度均低于对照组；LEfSe识别的判别类群中，含潜在机会性成员的类群（如莫拉菌科、假单胞菌科、气单胞菌科、希瓦氏菌科）呈上升趋势，含已知或潜在有益成员的类群（如梭杆菌科及其*Cetobacterium*、乳杆菌科）呈下降趋势，提示肠道微生态平衡发生改变。但研究人员强调，科水平16S rRNA基因测序无法确立毒力、感染性或感染风险，且FDR校正后无科水平差异保持显著。此外，毒代动力学、肠道氧化还原指标和菌群组成呈现一致的时间分层：第2天对应体内负荷峰值，此时抗氧化响应和菌群变化已出现；第8天体内负荷进入平台期，MDA升高，菌群中变化类群发生明显更替。研究人员也指出本研究的局限：实验设计无法区分氧化应激驱动菌群重塑、菌群变化影响宿主氧化还原状态，抑或二者仅由化学暴露平行触发；8 d暴露主要反映早期亚致死响应，不能涵盖长期适应或恢复过程；未进行组织学分析，缺乏肠道损伤形态学证据；主要关注肠道局部效应，未探讨"肠-肝轴"在全身毒性中的潜在介导作用；所用暴露浓度（7.33和73.3 μg/L）高于目前地表水检出浓度（如澳大利亚墨尔本地区平均0.19 μg/L），故所观察效应代表测试条件下的危害证据，不应直接外推至环境风险。

**结论**：本研究采用8 d亚致死暴露框架，整合分析了吡氟菌酰暴露斑马鱼的生物富集、肠道氧化应激和肠道菌群响应。吡氟菌酰表现出中等生物富集潜力，并诱导时间和浓度依赖性的肠道氧化应激；高浓度暴露与随时间增加的氧化应激相关，表现为MDA升高及SOD和GSH水平降低。肠道微生物群落结构受浓度和时间显著影响，而α-多样性响应有限。经FDR校正后无科水平差异保持显著，且未评估毒力或感染风险，因此所观察到的组成变化（包括假单胞菌门和浮霉菌门的相反趋势以及梭杆菌门和放线菌门的下降趋势）应视为探索性结果。总体而言，本研究为实验室条件下吡氟菌酰的危害表征提供了多层面证据。未来需结合组织病理学、屏障功能检测、更高分辨率的宏基因组学及环境相关浓度，以阐明这些响应的功能后果和生态相关性。