超高压处理（HHP）作为羽扇豆蛋白分离物（LPI）功能改性工具的研究：结构修饰与凝胶性能提升

《Food and Bioprocess Technology》：High Hydrostatic Pressure: A Tool for Functional Modification of Lupin Protein Isolates

　　

专业摘要翻译 本研究旨在评估超高压处理（HHP）作为蛋白质功能化改性方法的应用潜力。以黄羽扇豆（Lupinus luteus）来源的羽扇豆蛋白分离物（LPI）为研究对象，研究人员将其分别在200、350和500 MPa压力下于20 °C处理10 min，并考察了HHP处理对蛋白质结构及技术功能特性的影响。HHP处理诱导了蛋白质二级和三级结构的改变，导致蛋白质部分去折叠。荧光强度降低伴随表面疏水性增加，表明蛋白质发生部分去折叠并将疏水基团暴露于水相环境中。构象变化还促进了巯基（SH）基团的暴露，提示分子间二硫键的形成和/或重排可能促进了蛋白质聚集，这一推断得到了凝胶电泳结果以及在500 MPa条件下游离巯基含量降低的佐证。然而，粒径分布结果表明，解离/较小分子物种与较大聚集体共存，而非粒径的均匀增大。这些结构改变与溶解度增加和乳化活性降低相关联。200和350 MPa处理使LPI的最低凝胶浓度（LGC）从13%降至11%，表明凝胶能力得到改善，黏弹性结果证实形成了更强的凝胶网络，尤其在350 MPa条件下更为显著。与350 MPa相比，500 MPa处理对凝胶能力产生了较不利的影响，这可能是由于进一步的蛋白质聚集所致。总体而言，研究结果表明，HHP可用于修饰羽扇豆蛋白结构并调控其技术功能性，从而促进羽扇豆蛋白作为食品基质中胶凝剂的应用。

论文解读

一、研究背景与目的

全球人口持续增长带来了对高蛋白食品的更大需求，消费者对畜牧养殖的环境影响、可持续性及动物福利问题日益关注。利用植物蛋白作为动物蛋白的可持续替代品，成为满足全球食品蛋白需求的重要途径。豆类蛋白被认为是最有前景的动物蛋白替代来源之一，约占人类膳食蛋白摄入的33%。羽扇豆（Lupinus sp.，豆科）因其高蛋白含量、营养价值及有益健康效应，作为替代大豆蛋白的植物蛋白来源受到广泛关注。羽扇豆蛋白分离物（LPI）展现出包括溶解性、乳化性、起泡性和凝胶性在内的多种技术功能特性，使其成为多种食品应用中颇具前景的配料。

蛋白质形成凝胶的能力赋予食品结构和质构特性，对许多肉制品（如博洛尼亚香肠、熟火腿）及其植物基类似物尤为重要。热诱导凝胶化是植物球蛋白凝胶化的最常见机制之一，涉及分子去折叠、解离-缔合和蛋白质聚集等过程。然而，与大豆蛋白分离物相比，LPI的热诱导凝胶性能较弱，这一行为与羽扇豆蛋白分子在热处理时去折叠能力有限有关，其原因在于其较高的变性温度。据报道，羽扇豆蛋白分离物中β-和α-伴羽扇豆球蛋白组分的峰值变性温度分别约为88和105 °C，而大豆7S和11S球蛋白分别约为71和87 °C。研究表明，LPI颗粒的热稳定性与其高巯基（SH）含量相关，较多的分子内键增强了结构稳定性，从而抑制了热去折叠和聚集。因此，LPI在开发低黏度食品方面被提出作为有价值的技术功能蛋白，但其在半固态食品产品（特别是胶凝化肉类类似物）中的商业应用受到限制。

近年来，多种策略被用于改善植物蛋白的功能性并增强其在食品工业中的应用。其中，超高压处理（HHP）在修饰和调控蛋白质某些理化及功能属性（如形成聚集体或凝胶的能力）方面展现出良好潜力，且对感官和营养品质的损失极小。HHP是一种高效的非热技术，可修饰蛋白质的四级、三级和二级结构。四级结构在150–200 MPa的中等压力下解离，三级结构在200 MPa以上可被显著改变，而二级结构的变化则发生在300 MPa以上的较高压力下。总体而言，HHP主要破坏非共价相互作用（包括疏水相互作用和静电相互作用），促进蛋白质部分去折叠和构象重排。然而，关于羽扇豆蛋白耐压性的信息仍然相当有限。

尽管已有研究考察了HHP处理对LPI分散液结构特征和体外胃肠道消化率的影响，但HHP处理对LPI凝胶化的技术功能后果——包括最低凝胶浓度（LGC）以及完整加热-冷却循环中热诱导凝胶的黏弹性行为，连同表面疏水性、游离巯基/二硫键含量和粒径分布对凝胶化行为的潜在贡献——仍未得到探索。本研究通过考察较低固定蛋白浓度（5% w/w）在较低至中等压力范围（200–500 MPa，10 min）下的处理，填补了这一空白，重点关注热诱导LPI凝胶化的结构决定因素。研究人员假设HHP可诱导LPI部分去折叠并增加埋藏疏水基团和游离SH基团的暴露，从而增强结构柔韧性，促进蛋白质-蛋白质相互作用和分子间二硫键的形成，进而可能改善LPI的凝胶化及其他技术功能特性。因此，本研究旨在评估HHP处理对来源于黄羽扇豆（Lupinus luteus）的羽扇豆蛋白结构及其技术功能特性的修饰作用，特别关注凝胶行为。

二、研究设计与技术方法

研究人员采用碱溶酸沉法制备LPI，将羽扇豆粉分散于蒸馏水中，调节pH至10.3以溶解蛋白质，离心后取上清液调节pH至4.7使蛋白质沉淀，经洗涤、冻干后获得LPI，蛋白含量为84 ± 1%（干基）。将5% w/w的LPI水分散液分别进行200、350和500 MPa的HHP处理10 min（20 °C），以未处理样品为对照，每组三个独立实验重复。主要采用的技术方法包括：衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析蛋白质二级结构；内源荧光光谱评估三级结构变化；1-苯胺基-8-萘磺酸（ANS）荧光探针法测定表面疏水性（H₀）；Ellman试剂法测定游离巯基（SH）和二硫键（S–S）含量；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析分子量分布；动态光散射（DLS）测定粒径和ζ-电位；以及流变学表征热诱导凝胶化行为。

三、研究结果

分子结构变化

ATR-FTIR分析表明，LPI的二级结构以β-折叠和β-转角为主，α-螺旋比例较低。对照样品的二级结构组成为：β-折叠30.2%、β-转角27.3%、α-螺旋18.4%、无规卷曲3.4%、聚集体A1和A2分别为14.6%和6.2%。与对照相比，350 MPa处理显著增加了无规卷曲比例（11.8%）并降低了聚集体A2含量（3.8%）。200和350 MPa处理呈现最高的β-折叠含量（分别为32.5%和31.9%），而500 MPa处理最低（25.7%）。所有HHP处理均呈现α-螺旋和β-转角降低的趋势，500 MPa还呈现聚集体A1增加的趋势（19.5%）。

内源荧光分析显示，350和500 MPa处理导致最大荧光强度（FI）显著降低，并伴随最大发射波长（λ_max）红移1–5 nm，表明色氨酸（Trp）残基暴露于极性水相环境。表面疏水性（H₀）随压力从200 MPa增至500 MPa而显著增加，350和500 MPa处理达到最高值（分别为282 ± 11和284 ± 23），表明压力诱导的构象重排在350 MPa时达到最大程度。

巯基含量测定显示，500 MPa处理显著降低了游离SH含量，而总SH和S–S键含量在各处理间无显著差异，提示游离SH的减少可能源于新S–S键的形成和/或已有S–S键的重排。

SDS-PAGE分析显示，非还原条件下HHP处理导致高分子量（>150 kDa）弥散条带出现，其强度和程度随压力增加而增强，500 MPa时对应约250 kDa。还原条件下高分子量弥散条带消失，表明蛋白质聚集主要通过非共价和/或二硫键介导的缔合实现。值得注意的是，对照样品中约17 kDa的蛋白条带（可能对应δ-伴羽扇豆球蛋白）在非还原条件下随压力增加逐渐消失，提示其参与了分子间S–S键的形成。

粒径分析表明，对照样品主峰约10 nm（占总体积95%），另有87 nm小峰。200 MPa处理粒径分布与对照相似。350 MPa处理呈现约7 nm主峰伴随约37和298 nm的次峰，表明解离/较小物种与较大聚集体共存。500 MPa处理变化最为显著，10 nm以下颗粒消失，主峰移至约62 nm，表明更大程度的蛋白质聚集。Dv50和Dv90值在350和500 MPa处理下显著增加。ζ-电位在所有样品中保持恒定（约?25 mV）。

技术功能特性

蛋白溶解度测定显示，200 MPa处理使LPI溶解度显著提高至69.3 ± 1.0%，350和500 MPa处理分别为66.3 ± 2.9%和65.1 ± 0.4%，但与对照（62.8 ± 0.6%）无显著差异。乳化活性指数（EAI）方面，200 MPa处理值最高（62.0 ± 3.9 m2/g），但与对照（54.9 ± 9.5 m2/g）无统计学差异；200 MPa以上压力使EAI降低超过50%。乳化稳定性（ES₁₀）在各处理间无显著差异（83.2–89.2%）。起泡性能方面，HHP处理对起泡能力（FC）和起泡稳定性（FS₁₀）无显著影响。

凝胶能力测定显示，200和350 MPa处理使LGC从13%降至11%，500 MPa处理降至12%，表明HHP处理改善了蛋白质的凝胶能力。

流变学表征

动态流变学分析显示，所有样品在加热初期G″高于G′。对照和350 MPa处理的胶凝温度（T_gel）分别为53和55 °C，而200和500 MPa处理延迟至80和82 °C。加热至90 °C时，HHP处理样品的G′值较对照急剧增加（对照、200、350和500 MPa分别为3、11、272和17 Pa），表明形成更强的凝胶网络。冷却阶段结束时，HHP处理样品的G′值均高于对照，但仅350 MPa处理与对照达到显著差异，表明350 MPa为最适处理条件。

四、讨论与结论

FTIR分析揭示HHP处理诱导了LPI二级结构改变，α-螺旋含量随压力增加呈降低趋势，伴随无规卷曲含量增加（尤其在350 MPa），表明HHP破坏了稳定α-螺旋结构的氢键并促进了蛋白质部分去折叠和构象重排。β-折叠含量在200和350 MPa呈现非显著增加趋势，可能反映了部分去折叠蛋白质缔合时形成的非天然分子间β-折叠的贡献。350 MPa处理降低聚集体A2含量表明分子内蛋白质聚集减少，伴随部分蛋白质去折叠；而500 MPa处理呈现分子间β-折叠聚集（聚集体A1）增加趋势，表明压力诱导的构象重排通过疏水位点暴露促进了蛋白质-蛋白质聚集。

荧光光谱的红移和FI降低证实了350和500 MPa处理导致Trp暴露于极性环境，源于蛋白质部分去折叠和构象重排。H₀随压力增加而升高，但350 MPa后不再增加，表明构象重排程度在该压力水平达到最大。500 MPa时H₀未进一步增加可能归因于过度暴露的疏水区域使蛋白质更易聚集。

游离SH含量在500 MPa处理下显著降低，结合SDS-PAGE中高分子量条带在还原条件下消失以及约17 kDa条带（可能为δ-伴羽扇豆球蛋白）的逐渐消失，表明500 MPa下的蛋白质聚集主要通过分子间S–S桥接实现，可能涉及δ-伴羽扇豆球蛋白的参与。粒径分析进一步证实了350和500 MPa处理下蛋白质聚集的发生。

总体而言，HHP处理通过诱导LPI部分去折叠、暴露疏水基团和游离SH基团，增强了蛋白质结构柔韧性，促进了蛋白质-蛋白质相互作用和分子间二硫键形成，从而改善了LPI的凝胶能力。350 MPa被确定为最适处理条件，此时凝胶网络强度达到最大值。该研究证实HHP可作为修饰羽扇豆蛋白结构并调控其技术功能特性的有效工具，为LPI作为食品基质中胶凝剂的应用提供了科学依据，对开发植物基凝胶食品（特别是肉类类似物）具有重要应用价值。