维生素K1负载PLGA-PEI纳米颗粒通过FSP1依赖性铁死亡抑制促进糖尿病创面愈合

《Research》：Vitamin K1-Loaded Poly(Lactic-Co-Glycolic Acid)-Polyethylenimine Nanoparticles Promote Diabetic Wound Healing through FSP1-Dependent Suppression of Ferroptosis

　　

糖尿病创面愈合受损是一个重大的临床挑战，其驱动因素包括持续性氧化应激和细胞反应失调。本研究开发了一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙烯亚胺（PLGA-PEI）的纳米平台，用于维生素K1（VK1）的持续递送，通过涉及铁死亡抑制蛋白1（FSP1）的铁死亡抑制来增强糖尿病创面愈合。所制备的PLGA-PEI-VK1纳米颗粒表现出相对均匀的粒径分布、VK1持续释放、良好的血液相容性和增强的抗氧化活性。网络药理学分析提示，VK1相关靶点与氧化还原调节、细胞迁移和铁死亡相关过程密切相关。在体外实验中，PLGA-PEI-VK1纳米颗粒保护L929成纤维细胞免受晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导的损伤；增强细胞增殖和迁移；减轻活性氧（ROS）积累、细胞内Fe2+超载和脂质过氧化；恢复抗氧化能力；并增加FSP1表达。在糖尿病小鼠模型中，PLGA-PEI-VK1纳米颗粒显著加速创面闭合，改善组织再生和基质重塑，支持其体内治疗潜力。在机制层面，分子对接、细胞热位移分析（CETSA）和分子动力学模拟支持VK1与FSP1之间的相互作用。此外，药理学抑制FSP1显著削弱了PLGA-PEI-VK1的抗铁死亡效应，支持FSP1在VK1依赖性铁死亡抑制中的重要作用。这些发现表明，PLGA-PEI介导的VK1递送至少部分通过FSP1相关的铁死亡抑制促进糖尿病创面修复，并为糖尿病创面管理提供了一种潜在的纳米治疗策略。

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一、研究背景与科学问题

糖尿病（DM）已成为全球重大公共卫生挑战，据国际糖尿病联盟预测，到2045年全球将有约7.83亿成年人罹患糖尿病。在糖尿病众多并发症中，糖尿病足溃疡是最具破坏性的类型之一，约25%的糖尿病患者一生中会受到影响。这类创面的病理特征表现为持续性炎症、血管生成受损和再上皮化延迟，往往进展为慢性难愈性溃疡，严重者最终可能需要截肢，给患者和社会医疗系统带来沉重负担。

糖尿病创面愈合受损的发病机制涉及多因素病理过程，包括晚期糖基化终末产物（AGEs）的积累和持续性氧化应激。近年来，铁死亡作为一种新型调节性细胞死亡形式，已被证实在包括糖尿病并发症在内的多种病理状态中发挥重要作用。铁死亡是一种铁依赖性过程，由铁稳态紊乱和抗氧化防御机制受损导致的过度脂质过氧化所驱动。在糖尿病创面微环境中，AGEs可诱导内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞发生铁死亡，损害血管生成和组织再生。值得注意的是，AGEs可下调内皮细胞中铁死亡抑制蛋白1（FSP1）的表达，增加铁死亡并降低血管生成能力。

FSP1通过酶促还原泛醌（CoQ10）为泛醇，清除脂质过氧自由基，通过GPX4非依赖性通路抑制铁死亡，是铁死亡的关键调控因子。维生素K1（VK1）传统上被认为在凝血级联和骨代谢中发挥重要作用，但近年研究发现其还具有抗氧化、抗炎和细胞保护等多种生物学活性。然而，VK1的临床应用受到低生物利用度、水溶性差和血浆半衰期短等不利理化性质的限制。基于此，研究人员构建了PLGA-PEI杂合纳米颗粒系统以实现VK1的持续递送，探索其通过FSP1依赖性铁死亡抑制促进糖尿病创面愈合的可行性。

二、研究设计与技术方法

研究人员采用单乳液溶剂蒸发法制备PLGA-PEI-VK1纳米颗粒，并通过动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）等手段对纳米颗粒进行表征。体外实验采用L929小鼠成纤维细胞，以200 μg/mL AGEs建立糖尿病应激相关细胞模型。体内实验采用8周龄雄性C57BL/6小鼠，通过链脲佐菌素（STZ）单次腹腔注射（100 mg/kg）诱导1型糖尿病模型，随后建立全层切除创面模型，每日皮下给药治疗12天。此外，研究还运用了网络药理学分析、转录组测序、分子对接、细胞热位移分析（CETSA）和分子动力学模拟等关键技术方法。

三、主要研究结果

网络药理学预测VK1在糖尿病创面中的潜在铁死亡相关机制

研究人员通过数据库检索获得9,572个糖尿病创面相关靶点和682个潜在VK1靶点，取交集得到494个重叠靶点。基因本体（GO）分子功能富集分析显示，VK1相关靶点主要富集于氧化还原酶活性、血红素结合、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸结合、电子转移活性和黄素腺嘌呤二核苷酸结合等功能。GO生物学过程分析显示富集于表皮生长因子受体信号、成纤维细胞生长因子受体信号、细胞迁移、内皮细胞增殖和迁移以及创面愈合相关过程。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析和MCODE聚类分析鉴定出2个高度连接的功能模块，均与细胞增殖、迁移和血管生成相关。这些结果提示VK1可能通过调节氧化还原稳态和创面修复相关过程在糖尿病创面中发挥治疗作用。

PLGA-PEI-VK1纳米颗粒的表征

TEM成像显示PLGA-PEI-VK1纳米颗粒具有相对均匀的球形形态，平均直径为170.33 ± 12.98 nm，多分散指数为0.220 ± 0.021。体外释放分析显示约42%的VK1在24小时内释放，随后缓慢释放，支持其持续递送特性。Zeta电位、FTIR、XRD和XPS分析证实VK1成功载入PLGA-PEI纳米颗粒。溶血率低于3%，表明具有良好的血液相容性。ABTS和DPPH实验显示PLGA-PEI-VK1纳米颗粒具有增强的自由基清除活性，证实了VK1负载纳米制剂的抗氧化活性。

PLGA-PEI-VK1改善体内糖尿病创面愈合

在1型糖尿病小鼠创面模型中，PLGA-PEI-VK1治疗组在整个愈合期间创面闭合显著加快，且效果优于游离DMSO-VK1组。苏木精-伊红（H&E）染色显示PLGA-PEI-VK1治疗显著加速糖尿病小鼠背部皮肤修复，增加创面闭合率并恢复表皮厚度。Masson三色染色显示PLGA-PEI-VK1处理创面胶原沉积增强，胶原体积分数增加。这些结果表明PLGA-PEI-VK1加速了糖尿病创面的愈合，促进了表皮再生和胶原沉积。

PLGA-PEI-VK1恢复AGEs损伤的成纤维细胞增殖和迁移

体外实验中，AGEs+PLGA-PEI处理显著抑制L929细胞增殖和迁移，而PLGA-PEI-VK1治疗显著逆转了这一损伤。EdU掺入实验显示PLGA-PEI-VK1增加细胞增殖；流式细胞术细胞周期分析显示PLGA-PEI-VK1部分正常化细胞周期分布；增殖细胞核抗原（PCNA）免疫荧光染色显示PLGA-PEI-VK1恢复PCNA表达；Transwell迁移实验显示PLGA-PEI-VK1显著增加迁移细胞数；N-cadherin免疫荧光染色显示PLGA-PEI-VK1上调N-cadherin表达。值得注意的是，PLGA-PEI-VK1以显著低于游离VK1的VK1等效浓度给药，却产生了相当或更好的改善效果，表明PLGA-PEI介导的递送增强了VK1的表观细胞功效。

PLGA-PEI-VK1与线粒体呼吸通路调节和氧化应激减轻相关

转录组分析鉴定出270个差异表达基因，其中68个上调、202个下调。GO分析显示这些基因主要富集于焦亡炎症反应、炎症小体介导信号、凋亡、程序性细胞死亡和NLRP3炎症小体复合物组装调节等过程。TEM显示PLGA-PEI-VK1治疗组线粒体形态改善、超微结构保存更好。基因集富集分析（GSEA）显示PLGA-PEI-VK1与糖尿病创面异常线粒体呼吸相关转录状态的重塑相关。此外，PLGA-PEI-VK1治疗显著降低了糖尿病创面组织中丙二醛（MDA）水平。

PLGA-PEI-VK1改善AGEs诱导的铁死亡

PLGA-PEI-VK1显著减轻AGEs诱导的脂质过氧化，降低MDA水平，恢复过氧化氢酶（CAT）活性。AGEs诱导的ROS积累被PLGA-PEI-VK1显著降低。PLGA-PEI-VK1还显著减少AGEs诱导的细胞内Fe²⁺积累和脂质过氧化。游离VK1实验进一步证实，VK1通过抑制前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）上调、恢复铁蛋白重链1（FTH1）和铁蛋白轻链（FTL）表达，有效减轻AGEs诱导的铁死亡细胞死亡。

FSP1是VK1依赖性铁死亡调节的潜在介质

分子对接预测VK1与FSP1之间存在有利相互作用，结合能为?8.1 kcal/mol。VK1通过Phe21、Tyr296、Leu300、Thr327、Phe360和Thr367残基与FSP1相互作用，其中Tyr296与VK1形成氢键。AGEs暴露显著降低L929细胞中FSP1蛋白表达，而PLGA-PEI-VK1治疗恢复FSP1表达。CETSA显示VK1增加了FSP1的热稳定性。分子动力学模拟进一步支持FSP1-VK1复合物的动态稳定性，结合自由能计算显示?40.48 kcal/mol的能量有利复合物形成。相比之下，VK1与GPX4的分子对接预测结合能仅为?5.1 kcal/mol，且VK1治疗未恢复GPX4水平，表明GPX4不太可能是VK1活性的主要介质。

FSP1抑制减弱PLGA-PEI-VK1的抗铁死亡保护作用

使用FSP1抑制剂iFSP1和viFSP1进行药理学抑制实验，结果显示FSP1抑制显著削弱了PLGA-PEI-VK1抑制AGEs诱导的MDA增加、ROS积累、细胞内Fe²⁺积累和脂质过氧化以及恢复CAT活性的能力。在分子水平上，viFSP1部分逆转了VK1治疗诱导的铁死亡相关蛋白变化，增加PTGS2表达并降低FTH1表达。这些发现共同证明，药理学抑制FSP1显著损害了VK1抑制AGEs诱导铁死亡的能力，进一步支持FSP1是VK1依赖性抗铁死亡保护的重要介质。

四、讨论与结论

本研究证明VK1，特别是通过PLGA-PEI纳米颗粒递送的VK1，可增强糖尿病创面愈合，其治疗效应与铁死亡和氧化应激的抑制相关。机制研究进一步提示FSP1在该过程中发挥重要作用。PLGA-PEI杂合纳米颗粒系统结合了PLGA的可生物降解特性和PEI的阳离子特性，所制备的纳米颗粒具有纳米级粒径、正表面电荷和体外持续释放特性，且PLGA-PEI-VK1的治疗效果优于DMSO溶解的游离VK1，支持纳米包封对增强VK1治疗性能的益处。

从临床角度看，糖尿病足溃疡造成巨大的医疗负担，VK1已作为止血药物在临床使用，其已确立的临床应用可能为探索传统适应证之外的应用提供优势。基于FDA已批准化合物的再利用符合当前药物开发策略。PLGA-PEI纳米颗粒系统的模块化特性还支持未来加入其他治疗药物，如抗菌剂或生长因子，以应对糖尿病创面病理的多因素性质。

研究也存在一些局限性：VK1调控FSP1表达的上游分子事件尚不明确；动物模型不能完全反映人类糖尿病创面的慢性和复杂性；纳米颗粒的长期稳定性和对创面质量的影响需要进一步研究；PLGA-PEI-VK1优于游离VK1的具体机制有待阐明；血管生成相关结果未直接研究。

总之，本研究证明VK1对糖尿病创面愈合发挥治疗作用，其机制与FSP1依赖性铁死亡和氧化损伤的抑制相关。PLGA-PEI纳米颗粒系统实现了VK1的体外持续释放并支持其在糖尿病创面中的治疗效果。该策略为改善VK1在糖尿病创面愈合中的治疗应用提供了有前景的平台。此外，这些发现拓展了对维生素K生物学的理解，并提示对以铁死亡失调为特征的疾病具有更广泛的治疗意义。