移植人类光感受器在轻度和重度变性小鼠视网膜中的差异性存活、整合与成熟

《STAR Protocols》：Transplanted human photoreceptors differentially survive, incorporate, and mature in mildly and severely degenerated mouse retinae

　　

光感受器移植被认为是一种与疾病类型无关的治疗策略，适用于具有高度异质性遗传、分子和细胞病理特征的视网膜变性疾病。尽管此前的临床前研究已注意到来源于干细胞源性视网膜类器官的人类光感受器能够发生整合，但视网膜变性严重程度对移植效率的潜在影响尚未得到系统评估。本研究采用表现为轻度或重度视网膜变性的小鼠作为受体，移植人类诱导多能干细胞源性光感受器。在轻度变性视网膜中，供体细胞形成多细胞团簇，并从移植后3周（wpt）开始与Müller胶质细胞突起相互作用，最终在26 wpt时实现结构整合与成熟，表现为内节/外节及突触的形成。相比之下，在重度变性受体中，供体光感受器主要呈散在分布，整合或成熟迹象有限。单细胞RNA测序分析证实了供体细胞在轻度与重度宿主中的差异性成熟。然而，在重度模型变性过程早期进行移植，尽管内源性光感受器随时间完全丧失，供体光感受器仍能实现结构整合与成熟。本研究因此表明，供体光感受器的存活、整合与成熟取决于变性视网膜微环境，后者显著影响移植效率。

视网膜变性疾病（RDDs）的病理机制复杂且高度异质，最终导致光感受器不可逆丧失。细胞替代疗法被视为一种疾病不可知论的治疗策略，但既往研究主要集中在供体细胞制备和移植可行性上，对于宿主视网膜变性程度如何影响移植细胞的存活、整合与成熟知之甚少。研究人员利用轻度变性（Cpfl1）和重度变性（tg(Cpfl1/Rho?/?)）两种小鼠模型，系统比较了人类iPSC源性光感受器移植后的命运。结果显示，供体细胞在两种模型中均能长期存活至26周，但在轻度变性视网膜中，供体细胞形成多细胞团簇，与Müller胶质细胞建立广泛相互作用，完成结构整合并呈现成熟的光感受器形态，包括极化内节、外节样结构和带状突触形成；而在重度变性视网膜中，供体细胞散在分布，整合程度低，成熟标志物表达有限。单细胞RNA测序进一步证实，轻度宿主中供体光感受器的光转导、能量代谢和连接形成相关基因表达显著上调。值得注意的是，在重度模型早期进行移植，尽管内源性光感受器最终完全丧失，供体细胞仍能聚集、整合并成熟。这些发现首次系统证明了视网膜变性严重程度对移植效率的决定性影响，为未来针对不同疾病阶段优化移植策略提供了关键理论依据。研究人员采用了以下关键技术方法：利用CRX-mCherry报告基因iPSC系分化视网膜类器官，在第200天通过荧光激活细胞分选（FACS）富集mCherry+光感受器；将15万或50万个细胞悬液注射到亚视网膜空间，并结合玻璃体内注射免疫抑制剂；使用免疫组织化学、透射电子显微镜（TEM）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行多维度评估；定量分析移植物体积、内节形成和Müller胶质细胞反应。实验小鼠包括12–19周龄Cpfl1、15–18周龄tg(Cpfl1/Rho?/?)和4周龄tg(Cpfl1/Rho?/?)early受体。

**结果**：
**验证人类光感受器报告基因iPSC系以产生可移植的光感受器群体**：通过CRX启动子驱动mCherry表达的iPSC系分化视网膜类器官，D200类器官呈现层状结构，FACS分选后mCherry+细胞约占活细胞的65%，且表达光感受器标志物recoverin，确认了供体细胞的光感受器身份。
**宿主变性状态和Müller胶质细胞反应性的表征**：Cpfl1小鼠保留视杆细胞和ONL，属于轻度变性；tg(Cpfl1/Rho?/?)小鼠几乎完全丧失视杆和视锥细胞及ONL，属于重度变性。两种模型中Müller胶质细胞均呈反应性（GFAP上调），但重度模型中GFAP表达更强，且OLM呈不连续状态。
**移植细胞存活和聚集受宿主视网膜变性严重程度影响**：26 wpt时，Cpfl1宿主中移植物体积显著大于tg(Cpfl1/Rho?/?)宿主（6,349,581 μm3 vs. 2,340,832 μm3），且Cpfl1中供体细胞形成多细胞团簇并局限在特定区域，而重度宿主中细胞散在分布。
**宿主Müller胶质与移植光感受器的相互作用始于3 wpt**：在Cpfl1宿主中，Müller胶质突起通过“桥接”结构伸入移植物，OLM在接触点中断，SOX2+核从INL向移植物迁移；而重度宿主中未见此类交互。
**10和26 wpt时移植物的结构整合增强**：10 wpt时Cpfl1宿主中移植物部分整合入ONL，Müller胶质包裹供体细胞，TEM证实紧密连接形成；26 wpt时移植物完全整合，OLM重新封闭。重度宿主中整合程度较低，但随时间也有部分改善。
**供体细胞的成熟受变性微环境影响**：Cpfl1宿主中供体细胞形成顶端极化的内节样突起和视蛋白阳性的外节样结构，而重度宿主中这些结构罕见。hMITO定量显示Cpfl1中极化内节显著更多，TEM可见成熟内节、基底体和连接纤毛根。
**Cpfl1 vs. tg(Cpfl1/Rho?/?)宿主中供体细胞成熟标志物表达增加**：scRNA-seq证实供体细胞主要为视锥细胞（约80%），Cpfl1宿主中光转导、能量供应和连接形成相关基因表达更高，OPN1MW是差异表达最显著的基因之一。
**聚集的供体细胞在tg(Cpfl1/Rho?/?)宿主中并未改善整合和成熟**：即使将移植细胞数增至50万，重度宿主中供体细胞虽形成团簇，但仍缺乏Müller胶质交互和极化内节，表明单纯聚集不足以促进成熟。
**在进展性变性的早期阶段移植可改善供体细胞整合和成熟以及宿主双极细胞重塑**：4周龄重度模型接受移植后，供体细胞在26 wpt时形成成熟团簇，具有极化内节、Müller胶质包裹和新形成的OLM；同时宿主视锥双极细胞出现树突向移植物生长，而在未移植或晚期移植的眼中树突完全回缩。

**讨论总结**：本研究首次系统证明宿主视网膜变性严重程度显著影响移植光感受器的存活、聚集、整合和成熟。轻度变性环境（Cpfl1）提供了更有利于供体细胞成熟的条件，而重度变性环境（tg(Cpfl1/Rho?/?)）则限制这些过程。早期移植即使在持续变性的背景下也能实现有效整合，提示存在一个治疗窗口期。Müller胶质细胞作为第一响应者，其与供体细胞的相互作用可能是整合和成熟的关键驱动因素。研究还发现供体细胞聚集本身不足以促进成熟，突出了微环境因素的主导作用。这些发现对患者分层和移植时机选择具有重要临床意义。**研究结论**：本研究结果表明，光感受器移植物的发育和生理状态受受体环境的显著影响，在制定光感受器替代疗法时应充分考虑这一点。然而，患病视网膜的确切变性程度以及适合成功细胞替代治疗的治疗窗口仍需进一步界定。