猪流行性腹泻病毒（PEDV）S蛋白变异决定细胞嗜性及细胞进入途径

《Veterinary Sciences》：Spike Gene Variability in Porcine Epidemic Diarrhea Virus Determines Cell Tropism and the Route of Cell Entry

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是猪的重要肠道病原体，spike（S）蛋白决定病毒进入细胞的方式。冠状病毒可经质膜或内体（endosome）进入，但S蛋白变异是否改变进入途径本身及其与细胞和组织嗜性（tropism）的关系尚不清楚。本研究通过将细胞培养适应株G1b SD和强毒株G2b FJzz1的S基因引入G2b HM骨架，构建了仅S基因不同的同源重组PEDV（rPEDV）。rPEDV-HM-S^HM和rPEDV-HM-S^FJzz1感染需要外源胰蛋白酶，而rPEDV-HM-S^SD无需胰蛋白酶即可高效感染Vero细胞，且三者细胞嗜性不同。rPEDV-HM-S^SD感染BHK-21、Huh7、JHH7和Vero细胞最有效，但不能感染IPEC-J2细胞和猪肠道类器官，而两个依赖胰蛋白酶的嵌合病毒可感染这些细胞。组织蛋白酶（cathepsin）抑制剂E64d阻断rPEDV-HM-S^SD但不阻断依赖胰蛋白酶的病毒，而丝氨酸蛋白酶（serine protease）抑制剂camostat阻断依赖胰蛋白酶的嵌合病毒但不阻断rPEDV-HM-S^SD。此外，WDR81（WD repeat-containing protein 81）为rPEDV-HM-S^SD优先所需。总之，PEDV S蛋白决定蛋白酶依赖性、细胞嗜性和进入途径，细胞培养适应使进入转向内体途径，而该途径不再支持自然靶组织感染。

研究背景与目的：冠状病毒为有包膜、正单链RNA病毒，分α、β、γ、δ四个属；PEDV属α冠状病毒，感染小肠上皮细胞，引起新生仔猪急性水样腹泻、呕吐和脱水，死亡率可近100%。疫苗使用广泛，但S-INDEL和非S-INDEL等变异株仍反复暴发，涉及群体免疫不完整、管理生物安全及S抗原变化，各因素贡献尚未完全阐明。S蛋白为I类病毒融合蛋白，形成三聚体，S1介导受体附着，S2驱动膜融合；PEDV S1 N端结构域结合糖类附着因子，S1 C端含预测受体结合区。猪氨肽酶N（pAPN/CD13）曾被视为PEDV受体，但APN敲除细胞和猪仍易感，功能性受体仍未确定；唾液酸糖聚糖可作为附着因子，Siglec-15被提出为唾液酸依赖受体。冠状病毒进入有质膜途径和内体途径，其平衡取决于靶细胞蛋白酶谱和S序列。PEDV通常被认为经内体进入，但特定条件下也可能发生质膜融合。多数田间株如G2株在连续细胞系生长需胰蛋白酶，细胞培养适应株则不需；S2和单个S残基决定胰蛋白酶依赖，S基因决定PEDV对Vero和LLC-PK1细胞适应，但S变异是否切换进入途径及其与细胞、组织嗜性的关系尚不清楚。为此，研究人员构建仅S不同的同源重组PEDV，比较蛋白酶依赖、细胞系和猪肠道类器官嗜性及进入途径，以阐明S在进入途径可塑性和疫苗株选择中的意义。

关键技术方法：研究人员利用CRISPR/Cas9体外切割pYES1L-PEDV-HM-EGFP感染性克隆并替换S基因，构建携带HM、SD或FJzz1 S基因的重组PEDV；在Vero CCL-81等细胞中拯救和滴定病毒，采用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、免疫荧光、Western blot、50%组织培养感染剂量（TCID₅₀）、蚀斑和多步生长曲线评价；感染BHK-21、HeLa、Huh7、IPEC-J2、JHH7及猪空肠类器官2D/3D模型（类器官来源于10日龄仔猪空肠隐窝）；用E64d、camostat及CRISPR/Cas9 WDR81敲除Vero细胞结合流式细胞术判断进入途径。

研究结果：
3.1 携带异源S基因的重组PEDV构建与拯救：研究人员用Cas9/sgRNA切除HM S基因，将SD和FJzz1完整S基因组装入骨架，转染Vero后传三代获得rPEDV-HM-S^HM、rPEDV-HM-S^SD、rPEDV-HM-S^FJzz1；免疫荧光检测N蛋白、Western blot检测S蛋白，确认仅S不同的三株病毒拯救成功。
3.2 S基因决定胰蛋白酶依赖：比较有/无外源胰蛋白酶感染Vero，rPEDV-HM-S^HM和rPEDV-HM-S^FJzz1在胰蛋白酶存在时增强，rPEDV-HM-S^SD无胰蛋白酶即可高效感染；无胰蛋白酶时SD滴度达10^6.3 TCID₅₀/mL，HM和FJzz1仅10^2.2和10^2.7 TCID₅₀/mL，加胰蛋白酶后升至10^4.7和10^5.3 TCID₅₀/mL；蚀斑和生长曲线进一步支持S基因单独决定外源胰蛋白酶需求。
3.3 嵌合病毒在不同细胞系中的嗜性：感染五种不同种属和组织来源细胞系并检测EGFP，Huh7对三株均易感且SD最高；JHH7仅SD高效，HM和FJzz1仅少量感染；BHK-21仅SD支持；HeLa三株均弱；IPEC-J2呈相反模式，HM和FJzz1感染少量细胞，SD无EGFP信号。结论为S决定进入效率和细胞类型特异性，细胞培养适应SD S在猪肠上皮细胞感染差。
3.4 细胞培养适应PEDV在猪小肠类器官中感染受损：建立3D猪空肠类器官及2D单层，感染后24 h检测EGFP；2D和3D中HM和FJzz1产生EGFP阳性细胞，SD无信号。结论为细胞适应SD S支持猴和人细胞系高效感染，但不支持猪肠上皮感染。
3.5 胰蛋白酶非依赖S利用内体、cathepsin依赖途径：用E64d预处理并持续存在，CCK-8验证无细胞毒，荧光和流式检测显示E64d剂量依赖抑制SD，不抑制HM和FJzz1。结论为SD嵌合病毒依赖内体半胱氨酸cathepsin，胰蛋白酶依赖嵌合病毒不依赖该途径。
3.6 胰蛋白酶依赖S可能利用质膜途径：camostat预处理2 h后于感染前去除，CCK-8无细胞毒，流式和荧光检测显示camostat显著抑制HM（EGFP阳性从30.8%降至2.85%、3.05%、3.96%）和FJzz1（7.95%降至3.87%、1.87%、1.06%），不抑制SD。结果提示HM和FJzz1进入涉及camostat敏感丝氨酸蛋白酶，SD不敏感，与细胞表面丝氨酸蛋白酶促进胰蛋白酶依赖S经质膜融合相符。
3.7 WDR81优先为内体进入途径所需：用CRISPR/Cas9构建pooled WDR81敲除Vero及对照，感染后流式检测；WDR81缺失降低所有病毒但程度不同，SD从83.0%降至27.0%（约67%），HM从10.6%降至6.88%（约35%），FJzz1从25.6%降至17.6%（约31%）。结论为SD对WDR81依赖更强，符合其内体进入途径。

讨论总结：讨论指出，S足够决定胰蛋白酶需求、可感染细胞系、猪肠道细胞感染模式、所需蛋白酶活性和内体宿主因子，且这些表型与S共分离。SD S赋予胰蛋白酶非依赖、cathepsin抑制剂敏感和WDR81依赖，符合内体途径；HM和FJzz1 S赋予胰蛋白酶依赖和camostat敏感，提示丝氨酸蛋白酶需求；但未直接确定膜融合位点。该结果延伸了Wicht et al.、Tan et al.、Sun et al.及近期S决定Vero和LLC-PK1细胞适应的工作，并增加S变异改变所需蛋白酶、宿主因子和细胞区室这一维度。最显著发现是细胞培养适应相关嗜性权衡：SD感染Vero、BHK-21、Huh7、JHH7更高效，但IPEC-J2和类器官无EGFP，而胰蛋白酶依赖嵌合病毒至少感染部分细胞；提示连续细胞系传代选择优化进入培养细胞的S，可能牺牲自然靶组织感染能力。对疫苗开发而言，细胞适应株用于减毒活疫苗候选和灭活疫苗种子；活疫苗需在肠上皮复制以诱导黏膜和乳源免疫，灭活疫苗主要依赖与当前流行株的抗原匹配；针对细胞适应株的中和抗体滴度可能高估对仔猪保护，因为新生仔猪保护很大程度上依赖母源肠道IgA。候选疫苗株应评估连续细胞系生长、肠道嗜性、对当代分离株中和广度和仔猪保护效力。研究人员提出模型：HM和FJzz1等胰蛋白酶依赖S被细胞相关丝氨酸蛋白酶切割，在质膜或附近融合，符合camostat阻断、不依赖内体cathepsin且仅部分依赖WDR81；SD等胰蛋白酶非依赖S依赖内体半胱氨酸cathepsin和WDR81介导的内体成熟。此分化类似PDCoV双途径。肠道腔含丰富胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，包括胰腺胰蛋白酶和肠上皮细胞相关II型跨膜丝氨酸蛋白酶，因此田间株所需蛋白酶活性在自然感染部位常备，可解释HM和FJzz1在连续细胞系需外源胰蛋白酶却在猪肠上皮有效。研究人员提出田间株主要经质膜融合进入肠上皮，细胞传代可能选择不再需要表面蛋白酶激活的S，从而偏向内体途径；细胞培养研究中的内体途径可能反映传代株适应而非田间株肠道进入策略。但激活蛋白酶身份未知，2D和3D模型不能完全复现腔面蛋白酶环境，需仔猪蛋白酶抑制剂处理或肠上皮顶端融合事件成像直接证明。局限性包括：24 h EGFP评分反映进入和复制，不能区分二者；WDR81编辑后胰蛋白酶依赖嵌合病毒部分抑制（31–35%）可能反映次要内体途径或WDR81缺失的间接进入后效应，且pooled编辑群体含未编辑细胞，抑制更可能被低估，需单周期进入实验；camostat抑制多种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，未鉴定Vero中激活HM和FJzz1 S的酶，虽感染前去除仍阻断，说明相关蛋白酶为细胞相关，仅确定需求而非融合位点；嵌合病毒未全基因组测序，未检测S1/S2和S2′切割产物，SD为单一G1b株且长期传代，谱系相关和适应相关差异不能分开；所有实验在细胞系和新生仔猪猪肠道类器官中进行，体内各途径贡献及SD S在肠细胞所用附着因子未知。

研究结论翻译：总之，研究表明，在其余背景相同的骨架中交换S足以改变蛋白酶依赖、感染细胞类型、对cathepsin抑制和WDR81扰动的敏感性。细胞培养适应G1b SD S赋予胰蛋白酶非依赖、cathepsin和WDR81依赖的内体途径进入，但不能感染猪肠道细胞或类器官。G2b HM和FJzz1 S赋予胰蛋白酶依赖，需要camostat敏感细胞表面蛋白酶或外源胰蛋白酶，并且是唯一感染猪肠道细胞的嵌合病毒。由于单一S基因将感染所需蛋白酶与感染细胞范围耦合，选择疫苗株和解释蛋白酶抑制剂疗效时应考虑spike序列。