塞尔维亚Steinernema carpocapsae种群的首次记录、形态-分子特征、种内变异及其共生与伴生细菌对Galleria mellonella的昆虫致病性

《Journal of Helminthology》：Characterisation of Steinernema carpocapsae populations from Serbia with notes on intraspecific variability and entomopathogenicity of their symbiotic and associated bacteria

　　

作为昆虫病原线虫（entomopathogenic nematodes, EPN）广泛调查的一部分，研究人员在塞尔维亚阿瓦拉山（Mt Avala）首次发现Steinernema carpocapsae和S. thesami两个种。研究人员采用形态学和分子方法对S. carpocapsae的两个种群（AV10和AV27）进行特征描述。核糖体DNA内转录间隔区（ITS rDNA）测序确认两个分离株均为S. carpocapsae。对感染期幼虫（infective juveniles, IJ）以及第一代和第二代雄性进行形态测量学（morphometrics）检查，显示总体上为S. carpocapsae的典型特征，但观察到显著的种内变异（intraspecific variation）。研究人员提供了文献中已描述的S. carpocapsae种群间形态测量性状的比较。从感染的Galleria mellonella幼虫中分离线虫种群相关细菌，并通过16S rRNA和rpoB基因测序鉴定为Xenorhabdus nematophila、Serratia marcescens、Stenotrophomonas maltophilia、Enterococcus casseliflavus、Bacillus cereus、B. paranthracis和Priestia megaterium。致病性生物测定（pathogenicity bioassays）显示，经口给予细菌悬液未引起G. mellonella幼虫死亡，而直接注射入血腔（haemocoel）则对大多数分离株引起显著死亡。结果扩展了对S. carpocapsae形态多样性的认识，指出可能影响种内变异的一些原因，并提供证据表明线虫相关微生物群（nematode-associated microbiota）中的若干成员在血腔内施用时具有昆虫致病潜力（entomopathogenic potential）。

研究背景与目的：昆虫病原线虫（entomopathogenic nematodes, EPN）是重要的生物防治因子，Steinernema carpocapsae为世界性分布种，在巴尔干和欧洲多国已有记录。形态分析仍是线虫分类的基础，但种间形态相似和测量性状重叠使DNA测序及系统发育分析成为区分S. carpocapsae与近缘种的必要工具；同时，S. carpocapsae种内形态测量变异较大，已有种群描述存在方法学差异。S. carpocapsae与Xenorhabdus nematophila形成共生关系，线虫将细菌携带于肠道特殊囊泡并释放入昆虫血腔，细菌产生毒素和酶抑制免疫、降解组织，使宿主在24—48 h内死亡。除典型共生菌外，EPN相关尸体中还存在“第二细菌圈”（second bacterial circle），即环境和社会性细菌，其作用多不清楚。环境条件、尸体营养耗竭、提取时间及测量方法均可影响EPN形态测量。基于此，研究人员拟结合传统分类与遗传分析描述塞尔维亚S. carpocapsae种群，分离并分子鉴定其共生及可培养伴生细菌，测试其对Galleria mellonella的致病性，指出可能影响种内形态变异的因素，以提高物种鉴定准确性并加深对该线虫—细菌复合体多样性及生态学的理解。

研究开展与意义：研究对塞尔维亚贝尔格莱德附近阿瓦拉山76份土壤样品进行调查，首次在塞尔维亚记录S. carpocapsae和S. thesami，并对S. carpocapsae AV10和AV27进行形态测量、ITS rDNA系统发育及相关细菌分离鉴定和致病性测定。结果表明两分离株确为S. carpocapsae，且与欧洲及全球分离株高度相似；形态总体典型但存在显著种内变异，部分变异可能与提取时间和测量方法不一致有关；从感染尸体中分离到多种共生及伴生细菌，其中多数在血腔内注射时对G. mellonella具致病性，经口则无死亡。该研究扩展了S. carpocapsae形态多样性知识，提供了线虫相关微生物群成员具昆虫致病潜力的证据，并提示种群描述中的方法学差异可人为引入变异，对提高分类描述准确性及理解EPN—细菌复合体生态意义具有价值。

关键技术方法概括：样本队列来源为塞尔维亚贝尔格莱德附近阿瓦拉山76份土壤样品，其中30份来自Avala保护区自然生境，其余来自草甸、林缘草甸和农田等。关键技术包括：以G. mellonella末龄幼虫诱饵分离EPN；对IJ及第一、二代雄性进行形态测量学分析；扩增测序ITS rDNA并进行最大似然、邻接和最小进化系统发育分析；从感染G. mellonella血淋巴分离细菌，测序16S rRNA和rpoB并构建系统发育树；以注射和经口两种途径进行致病性生物测定，并用probit回归估计半数致死浓度（median lethal concentration, LC₅₀）和90%致死浓度（LC₉₀）。

研究结果：
（1）线虫分离株与分子鉴定（Nematode isolates and molecular identification）：通过土壤诱饵和ITS rDNA测序，76份样品中4份（5%）阳性，AV10和AV27鉴定为S. carpocapsae，AV24和AV35为S. thesami，二者均为塞尔维亚首次记录；AV10来自受人类活动干扰的林缘草甸，AV27来自天然混交林。AV10和AV27的ITS序列与GenBank中S. carpocapsae相应序列100%匹配，S. thesami分离株与KC287223.1分别有99.74%和99.87%同源性，确认了分离株身份。

（2）S. carpocapsae分离株的分子系统发育分析（Molecular phylogenetic analysis of Steinernema carpocapsae isolates）：通过ITS序列与已发表S. carpocapsae、“carpocapsae”组及外群S. feltiae构建系统发育树，邻接法、最大简约法和最小进化法分支顺序无冲突；最大似然树支持S. carpocapsae形成高支持分支，塞尔维亚两序列聚入其中，欧洲种群与一个伊朗序列形成中等支持亚支，其余非欧洲种群形成另一亚支。结论是塞尔维亚种群与欧洲及全球S. carpocapsae高度相似，但ITS对种内遗传差异分辨率有限。

（3）S. carpocapsae分离株的形态测量学分析（Morphometric analysis of Steinernema carpocapsae isolates）：通过IJ及第一、二代雄性测量，两群体总体符合S. carpocapsae典型特征，AV10的IJ多数均值接近Poinar描述的DD136及文献均值；AV27的IJ表现低排泄孔位置43.4、神经环87、长食道132.2和短尾50，导致E比例87.7、b比例4.1。第一代雄性AV10总体长（total body length, TBL）1850、最大体宽（maximum body width, MBW）144、食道长度（oesophagus length, EL）173、D比例38%，两群体引带长度（gubernaculum length, GuL）均值偏小（43和45），GS比例分别为65%和67%；第二代雄性较小细长。结论是存在显著种内形态变异，部分可能与提取时间及测量方法不一致有关，Poinar给出的部分比例可能需重新审视。

（4）分离细菌（Isolated bacteria）：通过从感染G. mellonella血淋巴分离并测序16S rRNA和rpoB，鉴定出X. nematophila、S. marcescens、S. maltophilia、E. casseliflavus、B. cereus、B. paranthracis和P. megaterium；X. nematophila和E. casseliflavus在两群体感染尸体中均分离到，P. megaterium、B. paranthracis和B. cereus仅见于AV27，S. marcescens仅见于AV10；重复诱饵中AV10原土未再获感染，AV27新感染尸体仅分离到X. nematophila、B. cereus和E. casseliflavus；未感染幼虫分离到Staphylococcus saprophyticus和Enterococcus mundtii，系统发育分析确认了鉴定。结论是两群体可培养相关细菌组成存在差异。

（5）共生与伴生细菌的致病性（Pathogenicity of symbiotic and associated bacteria）：通过注射和经口生物测定，所有测试细菌经口均未引起G. mellonella末龄幼虫死亡；注射后大多数分离株引起显著死亡且随浓度和时间增加。S. marcescens致病性最强，48 h时10³—10⁸ CFU/ml死亡率超过95%，最低10² CFU/ml亦超过85%；S. maltophilia的LC₅₀和LC₉₀分别为2.66×10³和7.54×10⁵ CFU/ml；E. casseliflavus的LC₅₀和LC₉₀分别为4.94×10⁶和5.09×10¹⁰ CFU/ml，10⁸ CFU/ml在96 h约85%死亡；X. nematophila AV10的LC₅₀和LC<90>分别为5.94×10⁴和6.25×10⁵ CFU/ml，AV27分别为3.81×10⁴和2.72×10⁸ CFU/ml；B. cereus和B. paranthracis在最大浓度注射时引起全部死亡，P. megaterium无毒。结论是多数分离株仅血腔内注射时具致病性，经口不致病。

讨论部分总结：研究人员讨论指出，EPN研究近年显著增加，第二细菌圈对线虫生物学和生态学的影响仍多未知；天然林阳性率高于农田和受干扰生境。ITS序列显示塞尔维亚种群属于S. carpocapsae且与欧洲及全球分离株高度相似，但ITS种内分辨率有限。形态变异方面，IJ提取时间可影响体长、尾长和排泄孔距离，测量方法不一致（如交合刺沿弧线或沿索测量）可造成GS等比例的人为变异；Poinar给出的部分比例与按性状均值计算的结果不一致，提示可能存误。雄性测量方法不一致亦可引入变异。致病性方面，经口无死亡可能反映细菌不能穿越肠道屏障或接种量不足；E. casseliflavus注射可致病但文献证据少；S. marcescens注射致病，经口致病性在不同来源菌株间可能不同；B. cereus、B. paranthracis、S. maltophilia和X. nematophila的结果与部分已发表研究可比。第二细菌圈成员可能需要线虫、核心共生菌、其他微生物或代谢物才能表达毒力；不同细菌组成可能影响尸体环境和线虫形态测量，但需直接检验。

研究结论部分翻译：总之，研究人员已证明从感染S. carpocapsae的尸体中分离的一些细菌对Galleria mellonella具有致病性。除S. carpocapsae种群间受遗传影响的差异外，研究人员已表明，一些变异可能源于种群描述中的方法学不一致，从而人为引入变异。在环境引起的差异中，研究人员推测不同细菌对所研究种群的形态测量学具有潜在影响。未来实验中有必要直接检验该假设，即在实验宿主中把细菌与EPN的感染期幼虫（IJ）一起注射。研究人员计划开展所发现细菌来源的研究。