《Journal of Bacteriology》：Lipopolysaccharide precursor mutants disrupt unipolar polysaccharide adhesin synthesis and cell surface functions in Agrobacterium tumefaciens
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根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种兼性植物病原体和冠瘿病的致病菌，能够通过极性定位的单极多糖（unipolar polysaccharide，UPP）黏附素附着于表面。UPP由两种不同形式组成，一种以N-乙酰葡糖胺残基为特征
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种兼性植物病原体和冠瘿病的致病菌，能够通过极性定位的单极多糖（unipolar polysaccharide，UPP）黏附素附着于表面。UPP由两种不同形式组成，一种以N-乙酰葡糖胺残基为特征（UPPGlcN），另一种以N-乙酰半乳糖胺残基为特征（UPPGalN）。在一个转座子筛选中，鉴定出两个推定参与dTDP-l-鼠李糖（dTDP-l-rhamnose）生物合成的基因rfbA和rfbD，它们特异性地参与UPPGalN的生物合成。对独立rfbA和rfbD突变体的检查验证了转座子突变体的表型，观察到UPPGalN特异性缺陷，以及所有rfb突变体中普遍存在的附着缺陷和UPP介导的细胞聚集。此外，尽管保留了鞭毛，rfb基因的突变仍导致鞭毛运动缺陷。能够拯救非运动性ΔrfbD表型的抑制突变破坏了剩余的rfb基因（rfbA、rfbB和rfbC）、磷酸葡萄糖变位酶exoC以及一个推定糖基转移酶ATU-RS21610。dTDP-l-鼠李糖途径中的单缺失突变体还具有外膜完整性受损的特征，例如对高分子量抗生素的敏感性增加，以及广泛保守的ChvG-ChvI双组分系统外膜应激反应靶基因表达增加。因此，dTDP-l-鼠李糖途径的缺陷导致多种细胞表面缺陷，导致外膜应激、鞭毛运动受损、UPP产生缺陷和不规则附着。
重要性：生物膜在不同背景下具有临床和工业相关性，对健康有重大影响并造成经济损失。表面附着和运动是细菌生物膜形成所必需的基本组成。许多微生物利用特定表面附属物或结构来促进附着和运动。本研究探讨了根癌农杆菌表面附着和后续生物膜形成的过程，揭示了生物膜形成所需多糖前体的产生与外膜功能（如运动和膜完整性）之间的联系。这些发现拓宽了对外膜表面功能之间复杂相互作用的理解，以及相关前体库的破坏如何产生多方面影响，可能成为新抗菌方法的有用靶点。
细菌生物膜是表面附着的细胞聚集体，具有重要临床和工业意义。根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是冠瘿病的致病菌，其表面附着和生物膜形成依赖极性定位的单极多糖（UPP）黏附素。UPP包含UPPGlcN和UPPGalN两种形式，分别由Wzy型聚合酶UppW和UppY驱动合成。前期转座子筛选发现rfbA和rfbD可能特异影响UPPGalN，但rfb基因是否参与其他细胞表面功能如运动和外膜完整性尚不清楚。本研究旨在系统解析dTDP-l-鼠李糖生物合成途径对UPP合成、生物膜形成、鞭毛运动和外膜完整性的影响。
研究人员通过构建rfbCBDA操纵子各基因的非极性缺失突变体，结合刚果红染色、荧光显微镜、生物膜定量、运动平板、抗生素敏感性、β-半乳糖苷酶报告基因及转座子抑制筛选，揭示了rfb基因的多效性作用。研究得出：rfbCBDA操纵子不仅提供dTDP-l-鼠李糖用于脂多糖/脂寡糖（LPS/LOS）合成，还影响UPP产生和附着，并与鞭毛运动和外膜应激密切相关。该发现有助于理解细菌细胞表面功能的复杂调控，为抗生物膜策略提供新靶点。
主要技术方法：研究人员使用农杆菌C58及其衍生物（如CDGS? ΔpruA，即去除纤维素、热凝胶、β-1,2-葡聚糖和琥珀酰聚糖并升高c-di-GMP的背景）构建突变体。采用Mariner转座子随机插入和反向PCR定位抑制突变；用刚果红染色和Calcofluor荧光标记检测UPP；用PVC盖玻片结晶紫染色定量生物膜；用0.25%琼脂运动平板检测鞭毛运动；提取LOS进行SDS-PAGE银染；用万古霉素和红霉素敏感性试验评估外膜通透性；用aopB-lacZ和chvI-lacZ转录融合的β-半乳糖苷酶活性测定ChvG-ChvI通路激活。
研究结果如下：
**根癌农杆菌rfbCBDA基因簇及推测的dTDP-β-l-鼠李糖生物合成途径**：rfbA和rfbD位于四基因操纵子rfbCBDA中，编码dTDP-β-l-鼠李糖合成所需的酶，该途径为LPS/LOS核心寡糖提供鼠李糖前体。
**rfbCBDA操纵子对根癌农杆菌多糖依赖性表型的贡献**：在野生型中，rfb突变体刚果红染色增加，但在UPP高产的CDGS? ΔpruA背景下染色降低；ΔrfbD在UPP高背景下附着显著减少，而其他rfb突变体虽有明显自聚集，但表面附着无显著变化。
**rfbA和rfbD在UPP聚合酶突变体中的多糖染色表型**：在缺失UppW（ΔuppW）且UPPGalN为主要UPP的背景下，rfbA和rfbD缺失导致刚果红染色减少和Calcofluor标记的UPP荧光灶减少，证实了最初筛选的UPPGalN特异性。
**rfbA和rfbD突变对UPP介导生物膜形成的差异影响**：rfbD缺失在ΔuppW背景下显著降低附着，而rfbA缺失影响较小，表明rfbD对UPPGalN依赖性附着更为关键。
**UPP介导聚集的刺激**：rfb突变体在液体培养中显著自聚集和形成pellicle，这种聚集依赖UPP，可被外源UppH糖苷水解酶去除，说明聚集通过UPP介导而非单纯外膜变化。
**rfbCBDA突变体运动受损**：rfb突变体，尤其ΔrfbD，显示鞭毛运动缺陷，但保留鞭毛结构，表明运动障碍源于鞭毛旋转或功能异常而非鞭毛丢失。
**运动抑制富集提示dTDP-β-l-鼠李糖代谢**：在ΔrfbD背景中进行转座子筛选，运动恢复的插入位点大部分位于rfbA、rfbB、rfbC、exoC和推定糖基转移酶ATU-RS21610中，提示中间代谢物积累可能是运动缺陷的原因。
**dTDP-β-l-鼠李糖途径失调破坏运动和生物膜形成**：组合缺失验证了rfbA、rfbB或rfbC缺失可部分抑制ΔrfbD的运动缺陷；在操纵子缺失突变体中异位表达rfbCBA或rfbAD导致运动进一步降低，支持中间产物积累有害的假设。
**rfb突变体激活外膜应激反应通路**：rfb突变体对万古霉素和红霉素敏感性增加，且ChvG-ChvI双组分系统靶基因（aopB和chvI）表达上调，说明外膜成分缺陷激活应激信号。
讨论部分指出，rfbCBDA操纵子不仅供应dTDP-l-鼠李糖，其突变还会导致外膜完整性受损、运动障碍和UPP产生缺陷。运动缺陷与外膜损伤关联，可能是由于dTDP-l-鼠李糖缺失导致前体代谢失衡，中间产物如4-酮-dTDP-β-l-鼠李糖积累，加剧外膜缺陷。ChvG-ChvI通路的激活是对外膜应激的响应，但可能不是运动缺陷的直接原因。该研究揭示靶向dTDP-l-鼠李糖途径可能同时干扰运动和生物膜形成，增强抗生素敏感性，具有抗菌应用潜力。
研究结论是：dTDP-l-鼠李糖途径的缺陷导致多种细胞表面缺陷，引起外膜应激、鞭毛运动受损、UPP产生缺陷和异常附着。这一发现拓宽了对细菌外膜功能与多糖前体代谢复杂相互作用的认知。
