Synergistota门胞外鞭毛钩FlgE蛋白中赖氨酸丙氨酸（Lal）交联的首次发现

《Journal of Bacteriology》：Lysinoalanine crosslinking in the extracellular flagellar hook of Synergistota

　　

摘要：细菌运动由鞭毛马达驱动，该马达是一个保守的大分子复合体，使细胞能够沿化学梯度导航。在螺旋体中，运动依赖于周质鞭毛，其功能由鞭毛钩蛋白FlgE中的一种独特翻译后修饰（post-translational modification, PTM）支持：相邻亚基间形成共价赖氨酸丙氨酸（lysinoalanine, Lal）交联。该修饰已被证明在螺旋体门内保守且为运动性所必需。在螺旋体中，Lal被认为提供额外的鞭毛钩稳定性，以满足周质有限空间内鞭毛旋转及缠绕细胞体相关负载的需求。基于对Lal形成所需保守催化残基的生物信息学筛选，研究人员探究了具有胞外鞭毛的细菌是否也产生Lal。联合使用生化交联实验和高分辨率质谱（high-resolution mass spectrometry），研究人员证明，Synergistota门运动成员Thermanaerovibrio acidaminovorans的FlgE在体外和野生型细胞培养中形成与螺旋体类似物相似的Lal交联。这些结果建立了胞外鞭毛钩中Lal交联的首个实例，以及螺旋体门外的首个实例。因此，Lal交联比先前认识更广泛保守，并可能代表增强胞外鞭毛和周质鞭毛钩稳定性与功能的一般机制。

重要性：许多细菌利用称为鞭毛的复杂旋转发动机推动自身向营养物质移动或远离有害环境。在螺旋体中，运动依赖鞭毛钩蛋白FlgE内赖氨酸丙氨酸（Lal）交联，以增强位于周质中的旋转鞭毛丝的万向节。该研究显示，在一种与螺旋体远缘相关且具有更典型胞外鞭毛的细菌Thermanaerovibrio acidaminovorans中，也存在同类型修饰。通过生化实验和质谱，研究人员确认其鞭毛钩蛋白自催化Lal交联，标志着该修饰首次在螺旋体外及胞外鞭毛中被观察到。这些发现提示，Lal交联比先前认为的更广泛保守，并可能代表细菌用于强化鞭毛的一般策略。由于运动性与生存及细菌致病能力密切相关，该发现改善了对细菌运动机制及其在多样物种中如何维持的理解。

一、研究背景与问题
细菌鞭毛马达（bacterial flagellar motor, BFM）是保守的大分子旋转机器，使细胞沿化学梯度运动。多数细菌的鞭毛丝通过约55 nm、由>120个FlgE亚基组成的鞭毛钩连接细胞体，钩作为柔性适配器传递扭矩。螺旋体门依赖周质鞭毛运动，其鞭毛钩蛋白FlgE存在相邻亚基间共价赖氨酸丙氨酸（lysinoalanine, Lal）交联。Lal由保守Cys经β-消除生成脱氢丙氨酸（dehydroalanine, DHA）并释放硫化氢（H₂S），随后DHA与相邻FlgE的Lys经aza-Michael加成形成。此前Lal已在6种代表性螺旋体、门内4个目中的3个目确认；突变催化/结构残基可保留钩和鞭毛丝组装但使细胞失去运动性。Lal曾被认为可能是螺旋体门特异适应，非螺旋体如Salmonella enterica未检出，且具有胞外鞭毛的细菌是否形成Lal未知。生物信息学筛选提示Synergistota门富含候选，研究人员选择该门运动成员Thermanaerovibrio acidaminovorans（Ta）检验。Ta为革兰阴性、中等嗜热、严格厌氧的弯曲杆菌，凹面有多条侧生胞外鞭毛，最初自荷兰糖厂分离。联合生化交联、定点突变和质谱，研究人员证明Ta FlgE在体外及野生型细胞培养中自催化形成与螺旋体类似的Lal交联；这是胞外鞭毛钩中Lal交联首例，也是螺旋体门外首例，提示Lal可能比此前认识更广泛保守，并可能为增强胞外及周与功能的一般机制。

二、关键技术方法
研究基于FlgE催化基序开展生物信息学筛选，并用AlphaFold3比较结构；重组表达、纯化Ta FlgE后，进行体外Lal交联实验、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）/银染、抗FlgE免疫印迹和定点突变；再以纳升液相色谱-串联质谱（nano-LC-MS/MS）及碰撞诱导解离（CID）、电子转移解离（ETD）或电子转移/高能碰撞解离（EThcD）鉴定交联肽。细胞样本为购自DSMZ的Ta DSM 6589静息期厌氧培养物；阳性对照B. burgdorferi B31 A3-68由Chunhao Li提供。

三、研究结果
1. T. acidaminovorans FlgE是Lal交联候选。以T. denticola FlgE为查询序列，要求CNL/SNL、催化Lys和催化Thr三个基序，筛得175个预测可形成Lal的FlgE序列，其中96/175（约55%）属Synergistota门。限定为已培养的验证型菌株后选择Ta。AlphaFold3模型显示Ta与Td FlgE三级结构相似，但Ta FlgE更大并多出D3、D4结构域。
2. T. acidaminovorans FlgE在SDS-PAGE交联实验中形成HMWCs。纯化Ta FlgE在交联缓冲液中48 h形成明显高分子量复合物（high-molecular-weight complexes, HMWCs），条带呈分子量阶梯；半胱氨酸反应性化合物可加速形成，与Cys180转化为DHA一致。C180A完全抑制，K167A仅少量HMWC，T507A降低约40%但未完全缺失。银染显示C180A和K167A存在非特异性条带，提示非特异性FlgE-FlgE相互作用可使DHA与其他Lys形成Lal。
3. T. acidaminovorans FlgE中Lal交联肽的确认。LC-MS/MS检测到两种交联肽，较大者为主，均以多电荷态存在，单体样本无相应峰；ETD的c、z离子明确鉴定交联肽。亲本肽、DHA修饰肽及β-巯基乙醇加合肽的CID碎片支持DHA中间体途径。结论是Ta FlgE含Lal交联，且为螺旋体门外首例。
4. T. acidaminovorans中Lal交联FlgE的检测。对购自DSMZ的Ta DSM 6589全细胞裂解物行抗Bb FlgE免疫印迹，抗体交叉反应但亲和力较低；Ta裂解物出现明显FlgE HMWCs并迁移至积层部分。切取条带行液相色谱-质谱，提取离子色谱检测到[M+4H]⁴⁺和[M+6H]⁶⁺电荷态Lal交联肽，保留时间与体外样品相近。结论是Ta细胞内鞭毛钩存在Lal交联。
5. 含SNL序列扩展Lal候选。Leptospirales缺少CNL中的催化Cys而编码Ser，但L. interrogans仍可检出Lal，Td FlgE的Cys-to-Ser突变也可交联。以SNL、催化Lys和催化Thr重新筛选获282个候选，分布于多个门，以Pseudomonadota和Desulfobacterota最多；讨论指出多数属Pseudomonadota（193/68%）。结论是Lal候选范围可扩展至含SNL的FlgE，但尚需验证。

四、讨论与结论
Ta FlgE与螺旋体FlgE均经Cys→DHA→aza-Michael加成形成Lal。差异在于T507在Ta中并非绝对必需：Td T334与N179主链酰胺形成氢键以增强DHA C_β亲电性，Ta T507A仅使HMWC减少约40%，提示其作用相似但非严格必需。作者提出，Ta弯曲杆状细胞与凹面侧生胞外鞭毛的罕见组合可能要求更高扭矩和更强鞭毛钩；Ta FlgE较Td多出D3、D4，而空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni, C. jejuni）中额外结构域可增强钩稳定性，缺失D3/D4的突变体运动性降低且约90%细胞出现鞭毛丝断裂，支持结构强化需求。将Synergistota候选映射至16S rRNA树显示运动与非运动物种兼有，但所有运动物种均预测编码可形成Lal的FlgE；运动物种鞭毛位置多样（侧生、极生、极生+侧生或周生），故作者认为Lal更可能是细胞结构/鞭毛组织适应而非单纯环境适应。初筛仅纳入Cys而未纳入Ser会低估候选；SNL扩展筛得282个候选，多数属Pseudomonadota，仍需进一步验证。总体，Lal交联可能比此前认识更广泛。研究结论（译）：总体而言，最初被认为对螺旋体门特异的鞭毛钩蛋白FlgE中的Lal交联，可能代表一种比此前认识更广泛分布的翻译后修饰。