基于多重Fc阵列分析揭示TLR3对减毒活疫苗RVFV免疫后小鼠Th1型体液免疫应答的调控作用

《Journal of Virology》：Multiplexed Fc array assays reveal the influence of TLR3 on the Th1-biased humoral response induced in mice following live-attenuated RVFV vaccination

　　

摘要 裂谷热病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）可导致人类和家畜罹患严重疾病。多种候选疫苗在临床前动物模型中具有免疫原性和保护效力。既往疫苗接种后的体液免疫检测通常评估抗原特异性活性，如病毒结合或中和能力，但未考虑Fc段的作用。为弥补这一认知空白，研究人员开发了多重Fc阵列分析（multiplexed Fc array assays），用以表征RVFV疫苗接种后抗原特异性抗体的Fc谱。将RVFV核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）和糖蛋白（glycoproteins，Gn/Gc）偶联至磁珠微球，并使用单克隆抗体优化检测条件。将免疫小鼠血清与偶联微球共孵育以捕获抗原特异性抗体，随后采用多种检测试剂测定抗体的同种型（isotype）及其与Fc受体（Fc receptors，FcRs）或补体C1q的结合能力。两项涉及减毒活疫苗RVFV ΔNSsΔNSm或ΔNSs免疫小鼠的研究用于验证这些检测方法的实用性。在野生型（WT）C57BL/6小鼠中，ΔNSsΔNSm和ΔNSs均诱导高水平的IgG2c抗体，提示Th1型偏倚应答；这些抗体还能结合四种小鼠FcRs和C1q。然而，在ΔNSs感染一组先天免疫敲除（knockout，KO）小鼠后，多种KO小鼠品系（尤其是TLR3 KO）表现出IgG2c抗体水平降低，证实了先天免疫对Th1型偏倚应答的影响。总体而言，多重Fc阵列分析性能符合预期，未来可应用于其他RVFV疫苗平台，为合理疫苗设计提供参考。

多重Fc阵列分析揭示TLR3对减毒活RVFV疫苗诱导的小鼠Th1型体液免疫应答的调控作用

一、研究背景与科学问题

裂谷热病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）是一种经蚊媒传播的虫媒病毒，可感染人类和家畜，在非洲和中东地区广泛流行并多次引发疫情。RVFV感染在多数个体中表现为轻症，但可导致肝炎、出血热、视网膜炎或脑炎等严重并发症，病死率较高。RVFV被美国卫生与公众服务部（HHS）、美国农业部（USDA）和世界卫生组织（WHO）列为选择性病原体和新兴病原体。

尽管RVFV对人类健康构成严重威胁，目前尚无获批用于人类预防RVFV感染的疫苗。多种临床前候选疫苗处于不同研发阶段，包括减毒活疫苗、载体疫苗和亚单位疫苗等，其中部分已进入I期临床试验。减毒活疫苗DDVax（缺失毒力基因NSs和NSm，即ΔNSsΔNSm）是一种前景良好的候选疫苗，已在坦桑尼亚计划启动I期临床试验，并在小鼠、大鼠、妊娠母羊和狨猴中证实了安全性和免疫原性。另一减毒活疫苗株ΔNSs（缺失毒力基因NSs）在免疫 competent 小鼠中亦表现出安全性。

然而，既往针对ΔNSsΔNSm和ΔNSs的免疫原性研究多集中于总IgG结合滴度和病毒中和抗体的检测，这些检测仅涉及抗体的抗原结合片段（Fab），未考虑Fc段在保护中的作用，仅提供抗体质量的片面信息。抗体的Fc段可与免疫细胞表面的Fc受体（FcRs）结合或与补体成分C1q相互作用，诱导补体依赖性细胞毒作用和抗体依赖性细胞吞噬作用等功能，有助于抑制病毒复制。

多重Fc阵列分析已在多种感染、疫苗和抗体平台中得到应用，用于研究抗体的Fc谱，但尚未针对RVFV建立该方法。该技术利用偶联蛋白的微球同时捕获针对不同抗原的特异性抗体，同时评估其Fc谱，如同种型及与FcRs和补体的结合能力。既往研究已证实抗体质量同时取决于抗原特异性抗体的Fab和Fc区。例如，利用多重Fc阵列分析发现，疫苗接种前感染SARS-CoV-2的个体具有更高水平的抗原特异性IgG1和IgG2抗体（相当于小鼠的IgG2a/c和IgG3），以及更强的Fcγ受体（FcγRs）结合能力，这可能有助于改善再感染保护。另一项研究表明，在恒河猴猿免疫缺陷病毒（SIV）疫苗接种中，抗原特异性抗体的Fc谱比IgG结合滴度能更好地预测不同佐剂所赋予的保护效果。

基于上述背景，本研究旨在开发针对RVFV的多重Fc阵列分析，以表征疫苗接种后针对RVFV抗原的体液免疫应答特征，并将其应用于适应性和先天免疫研究，为未来疫苗设计提供参考。

二、研究内容与主要结论

研究人员开发了小鼠多重Fc阵列分析，可测定RVFV疫苗接种后抗原特异性抗体的同种型及其与FcγRs和补体成分C1q的结合能力。将RVFV核衣壳蛋白（N）和糖蛋白（Gn/Gc）偶联至磁珠微球，并以牛血清白蛋白（BSA）作为阴性对照。利用针对RVFV N或Gn蛋白的不同同种型单克隆抗体（mAbs）验证同种型检测和FcR检测的性能，结果显示各mAb仅被其同种型特异性检测抗体识别，且与四种FcγRs的结合模式符合既往文献报道。补体检测因单价抗体的效价要求限制无法用mAb验证，改用ΔNSsΔNSm免疫小鼠的多克隆血清进行验证，结果显示免疫血清与C1q的结合水平显著高于未免疫血清。

将所建立的多重Fc阵列分析应用于两项小鼠研究。第一项研究使用既往报道的RVFV ΔNSsΔNSm疫苗研究中的血清样本，WT C57BL/6小鼠接受低剂量（6 TCID??）或高剂量（8×10? TCID??）疫苗免疫，检测1个月和6个月免疫后（MPV）的血清。结果显示，N特异性抗体总水平从1 MPV至6 MPV显著下降，高剂量组Gn/Gc特异性抗体亦随时间下降。各同种型（IgG2c、IgG3、IgG1和IgG2b）总体呈下降趋势。无论剂量或时间，IgG2c均为主要同种型，提示ΔNSsΔNSm疫苗接种诱导Th1型偏倚应答，这与Th1细胞因子IFN-γ可促进向IgG2c类别转换的已知机制一致。FcR和补体检测显示，N和Gn/Gc特异性抗体可与四种FcγRs及C1q强结合，提示这些抗体具有诱导Fc效应功能的潜力。

第二项研究利用11种先天免疫敲除（KO）小鼠品系和WT C57BL/6小鼠，以2×10? TCID??的RVFV ΔNSs经足垫注射感染。STAT1 KO、STAT2 KO和IFNAR KO小鼠对ΔNSs感染高度易感，中位生存时间为2天，MAVS KO小鼠中位生存时间为6天，这些小鼠在肝、脾和脑中均检测到高水平的病毒RNA，其中肝脏载量最高，提示死于肝脏疾病。其余KO小鼠品系均存活至28天。对存活KO小鼠的终末血清进行Fc阵列分析发现，WT C57BL/6小鼠具有高水平的IgG2c抗原特异性抗体，证实ΔNSs诱导Th1型偏倚应答。然而，TLR3 KO小鼠的N和Gn/Gc特异性IgG2c抗体均显著降低，MyD88 KO、TRIF KO和TLR7 KO小鼠的N特异性IgG2c抗体亦有所降低。TNF-α KO小鼠的总抗原特异性抗体水平显著降低。FcR和补体检测结果显示，TNF-α KO小鼠的N和Gn/Gc特异性抗体与四种FcγRs的结合均显著降低，TLR3 KO小鼠与FcγRI、FcγRIIB和FcγRIV的结合显著降低，MyD88 KO小鼠与四种FcγRs的结合均降低。TLR3 KO、MyD88 KO和TLR7 KO小鼠的N特异性抗体与C1q的结合减少，TLR3 KO和TNF-α KO小鼠的Gn/Gc特异性抗体与C1q的结合减少。

三、关键技术与方法

本研究采用的主要技术方法包括：（1）多重Fc阵列分析（multiplexed Fc array assays）：将RVFV N和Gn/Gc蛋白及BSA偶联至三种不同磁珠微球区域，分别建立同种型检测、FcγR结合检测和补体C1q结合检测三种检测体系，利用Bio-Plex 200检测PE荧光信号；（2）单克隆抗体验证体系：使用针对RVFV N或Gn的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3四种同种型mAbs验证同种型和FcR检测的特异性和准确性；（3）先天免疫KO小鼠模型：使用11种基因特异性敲除小鼠品系（包括TLR3 KO、MyD88 KO、TRIF KO、TLR7 KO、TNF-α KO、NLRP3 KO、IFNLR KO、STAT1 KO、STAT2 KO、MAVS KO和IFNAR KO）及WT C57BL/6小鼠，感染RVFV ΔNSs后评估存活率和病毒RNA载量；（4）qRT-PCR：检测肝、脾、脑组织中的病毒RNA载量。动物实验方面，长期免疫研究使用8周龄雄性和雌性C57BL/6小鼠，先天免疫研究使用5至12周龄雌性小鼠，各KO品系购自Jackson Laboratories，STAT2 KO和IFNLR KO小鼠由匹兹堡大学John Alcorn博士惠赠。

四、研究结果

ΔNSsΔNSm疫苗接种诱导强Th1型偏倚应答，抗原特异性应答随时间和剂量变化

利用同种型检测对ΔNSsΔNSm疫苗研究中的1 MPV和6 MPV血清进行分析，发现N特异性抗体总水平随时间显著下降，高剂量组Gn/Gc特异性抗体亦随时间下降。IgG2c为优势同种型，与Th1型偏倚应答一致。FcR和补体检测显示N和Gn/Gc特异性抗体与四种FcγRs及C1q强结合，且结合能力随时间和剂量有所变化。

先天免疫组分对RVFV ΔNSs感染后的易感性贡献不同

STAT1 KO、STAT2 KO、IFNAR KO和MAVS KO小鼠在ΔNSs感染后死于肝脏疾病，表现为肝、脾、脑中高病毒RNA载量，提示MAVS介导的病毒感知、I型干扰素释放及STAT1/2异二聚体信号传导是预防小鼠肝脏疾病的关键先天免疫通路。其余KO品系均存活。

先天免疫RNA传感器和信号分子（尤其是TLR3）增强ΔNSs感染期间N和Gn/Gc特异性抗体的Th1型偏倚应答

TLR3 KO小鼠的N和Gn/Gc特异性IgG2c抗体显著降低，MyD88 KO、TRIF KO和TLR7 KO小鼠的N特异性IgG2c抗体亦降低。TNF-α KO小鼠总抗原特异性抗体水平降低。FcR和补体检测结果与同种型结果基本一致，TLR3 KO、MyD88 KO和TNF-α KO小鼠的抗体与FcγRs和C1q的结合能力降低。

五、讨论与结论

讨论部分总结

在讨论中，研究人员分析了亲和力（avidity）对多重Fc阵列分析的影响。单克隆抗体在微球上的聚集可增强低亲和力受体（如FcγRIII）的结合信号，而多克隆血清因能结合多个表位，通过Fc区更紧密的聚集提高亲和力，使C1q能够结合。关于ΔNSsΔNSm疫苗的适应性免疫特征，同种型检测证实了既往研究中体液应答随时间下降的发现，并与既往ELISA和FRNT??数据呈正相关。ΔNSsΔNSm诱导高度类别转换的抗原特异性抗体，以IgG2c为主，这与既往发现的病毒特异性CD4 T细胞以Th1为主一致，也解释了疫苗在不同时间和剂量下的保护效果。N特异性抗体水平高于Gn/Gc特异性抗体，可能反映N蛋白在感染细胞中的相对丰度更高或N具有更多免疫优势MHC II类表位。关于先天免疫对适应性免疫的影响，TLR3 KO小鼠的IgG2c类别转换受损最为显著，因为TLR3通过TRIF激活NF-κB，促进IL-12产生，驱动CD4 T细胞向Th1分化。MyD88和TRIF缺失时存在替代信号通路，因此对IgG2c的影响较轻。TNF-α KO小鼠因生发中心形成受损导致总体抗体应答降低。TLR7 KO小鼠表现为IgG1升高和IgG2c降低，提示应答偏向Th2型。

研究结论

本研究开发的多重Fc阵列分析在评估减毒活RVFV疫苗接种后抗原特异性抗体的Fc谱方面表现良好，证实了疫苗诱导强Th1型偏倚应答，且该应答依赖于先天免疫系统的不同组分。未来这些Fc阵列分析可用于进一步表征其他类型疫苗平台接种后抗原特异性抗体的质量，为合理设计新型疫苗提供参考，并可能有助于建立免疫保护相关性指标。