《Journal of Virology》：Expanded comparative genomics supports labial gland disease viruses as a distinct and deeply divergent lineage within Naldaviricetes
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唇腺疾病病毒（labial gland disease viruses, LGDVs）是近期发现的感染蚂蚁的双链DNA（dsDNA）病毒，但其多样性、基因组一致性及分类边界此前尚未明确。本研究通过挖掘公共节肢动物基因组组装数据并对野外采集的蚂蚁进行测序，扩展了
唇腺疾病病毒（labial gland disease viruses, LGDVs）是近期发现的感染蚂蚁的双链DNA（dsDNA）病毒，但其多样性、基因组一致性及分类边界此前尚未明确。本研究通过挖掘公共节肢动物基因组组装数据并对野外采集的蚂蚁进行测序，扩展了LGDV成员。研究人员从Pheidole selathorax、Proformica mongolica、Messor orientalis以及地理分布不同的Anoplolepis gracilipes种群中获得了新的LGDV基因组。比较基因组分析表明，LGDV保留了Naldaviricetes纲Lefavirales目中的保守核心基因，与西方蜜蜂丝状病毒（Apis mellifera filamentous virus, AmFV）及相关病毒（AmFV/AmFLV）共享额外保守基因，并编码一套LGDV限制性保守基因集。氨基酸一致性（amino acid identity, AAI）、保守位点及基因邻域分析支持LGDV的内部一致性，同时将其与AmFV/AmFLV区分开来——后者仅保留了部分局部基因邻域相似性，且与LGDV缺乏可检测的全基因组宏观共线性。基于蛋白质序列和结构推断的系统发育树大体一致，表明预测的蛋白质结构在深度分化的naldaviricetes中保留了互补的谱系判别信号，并将LGDV恢复为AmFV/AmFLV的单系姐妹群。分子定年进一步支持这些谱系之间存在深层分化，表明LGDV与AmFV/AmFLV代表不同且长期分化的类群，而非彼此近期衍生的分支。综上所述，这些发现支持LGDV作为Naldaviricetes纲Lefavirales目中一个内部一致、深度分化且与蚂蚁相关的病毒科。
一、研究背景与科学问题
大型双链DNA（dsDNA）病毒在Naldaviricetes纲内包含多个深度分化的谱系，其中Lefavirales目的成员共享一套高度保守的晚期表达因子基因（late expression factor genes, lef），可作为解析这类病毒演化关系的关键分子标记。然而，由于宏基因组和转录组资源中不断披露新的分歧病毒序列，naldaviricetes的采样仍不完整，现有分类框架下可能仍有未被识别的谱系。蚂蚁作为生态功能极为重要的社会性昆虫，其携带的大型dsDNA病毒却鲜有报道，形成了对病毒多样性、宿主范围及长期演化认知的重大空白。此前研究虽鉴定出两种唇腺疾病病毒（labial gland disease viruses, LGDVs）——Camponotus japonicus LGDV（CjLGDV）和Anoplolepis gracilipes LGDV（AgLGDV），并将其置于Naldaviricetes框架内，指出其与未分类的西方蜜蜂丝状病毒（Apis mellifera filamentous virus, AmFV）及类西方蜜蜂丝状病毒（Apis mellifera filamentous-like virus, AmFLV）存在演化关联，但仅有两条LGDV基因组可用，导致该病毒的多样性、基因组一致性及谱系边界均未充分界定。同时，LGDV与AmFV/AmFLV之间的共有基因究竟反映的是共同祖先后的谱系特异性分化，还是对naldaviricetes祖先特征的差异保留，亦不清楚。此外，深度序列分歧、饱和效应、比对不确定性及广泛的基因周转使得重建高度分歧大型dsDNA病毒间的深层关系极具挑战。
二、研究内容与主要结论
为解决上述问题，研究人员通过挖掘公共数据库并对野外采集的蚂蚁进行测序，扩展了LGDV的基因组多样性，整合比较基因组学与序列及结构指导的系统发育分析，评估了LGDV与AmFV/AmFLV及其他已知naldaviricetes之间的演化关系。研究确立了LGDV作为蚂蚁相关大型dsDNA病毒的一个深度分化且多样化的谱系，为确定LGDV与AmFV/AmFLV在Naldaviricetes纲内的系统发育分离和演化地位提供了证据。
三、关键技术方法
研究人员采用TBLASTN搜索NCBI全基因组鸟枪法数据库（Whole Genome Shotgun database），覆盖直翅目、双翅目、鳞翅目、鞘翅目和膜翅目五大节肢动物目；利用fastp进行测序读段质量控制与接头修剪，Bowtie2比对宿主参考基因组去除宿主序列，MEGAHIT进行de novo组装；使用MAFFT进行多序列比对，IQ-TREE v3构建最大似然系统发育树；应用AlphaFold3、ESMFold及ESMFold2预测蛋白质三级结构，并通过Foldmason v1.76生成基于三维相互作用字母表（3Di）的多重结构比对；采用MCMCtree结合近似似然法进行分子定年分析，校准节点为CiBV与MdBV的共同祖先时间。
四、研究结果
鉴定蚂蚁中的新型LGDV基因组： 以CjLGDV与AgLGDV间保守的11个基因为查询序列进行TBLASTN搜索，从三种蚂蚁基因组组装中鉴定出LGDV样支架，分别命名为PsLGDV（来自Pheidole selathorax）、PmLGDV（来自Proformica mongolica）和MoLGDV（来自Messor orientalis）。PsLGDV和MoLGDV获得完整的环状基因组，长度分别为115,132 bp和105,742 bp；PmLGDV因测序深度和质量较低未闭合，但回收序列达139,157 bp。此外，在中国两个地点的Anoplolepis gracilipes样本中鉴定出两株新的AgLGDV分离株（AgLGDV-CNX1和AgLGDV-CNFJ），均获得完整环状基因组，三者平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）高达98.8%–99.1%，基因组共线性强，分歧集中在特定可变区域。目前识别的LGDV基因组来自五个地理远隔的蚂蚁物种，表明该病毒在蚂蚁中具有广泛的分类和地理分布。蚁亚科（Formicinae）相关LGDV的GC含量为49%–53%，而切叶蚁亚科（Myrmicinae）相关LGDV的GC含量较低（38%–42%）且编码密度更高。
在蚂蚁RNA测序数据库中检测到LGDV转录本： 对467个公开转录组数据集进行筛查，在Camponotus japonicus的一个数据集和Anoplolepis gracilipes的两个数据集中检测到LGDV转录本，病毒读段占比较低（<1%），但映射至多个预测病毒开放阅读框（ORFs），其中几丁质结合结构域蛋白、ATP酶和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的转录本丰度较高，支持病毒在部分蚂蚁个体中的复制。
LGDV拥有naldaviricetes保守基因及LGDV限制性基因集： 所有LGDV基因组编码Naldaviricetes纲广泛保守的七个核心基因（p74、pif1、pif2、pif3、pif5、DNA聚合酶DNApol和硫氢基氧化酶p33），以及Lefavirales目特有的五个特征基因（ac81、lef4、lef5、lef8、lef9）。pif4、ATP酶、解旋酶、解旋酶2、整合酶和甲基转移酶的同源物在所有LGDV中普遍存在，但在部分naldaviricetes中缺失。LGDV与AmFV/AmFLV共享八个特异保守基因（CjLGDV_orf7、orf18、orf23、orf47、orf48、orf77、orf94和orf113），其中orf77和orf94编码的蛋白已被确认为AmFV-CN病毒颗粒的结构成分。此外，11个基因仅在已识别的LGDV基因组中保留，功能未知。Formicinae宿主相关LGDV额外共享两个基因（CjLGDV_orf6和CjLGDV_orf26），后者注释为推定的DNA连接酶。
LGDV与AmFV/AmFLV具有不同的保守氨基酸特征： 氨基酸一致性（AAI）分析显示，LGDV内部成对比较的AAI值高于LGDV与其他病毒的比较，且LGDV与AmFV/AmFLV间的AAI值高于LGDV与其他Lefavirales成员的比较。层级聚类将LGDV归为一个紧密簇，AmFV/AmFLV位于最近邻簇。在Lefavirales保守基因产物比对中，LGDV含有680个严格保守氨基酸位点（其中69个为LGDV特有），AmFV和AmFLV含有2,468个严格保守位点（其中651个为其特有），两者共享335个相同位点（其中42个在其他病毒家族中不存在），另有83个位点呈分歧保守模式。
LGDV表现出谱系特异性基因排列并与AmFV/AmFLV存在局部相似性： 基因组共线性分析显示，LGDV之间具有高水平的成对共线性，但与AmFV/AmFLV或其他Lefavirales代表成员之间未检测到大范围共线区块。然而，AmFV/AmFLV在2–6号位点保留了与LGDV的部分局部相似性，表明这些位点源于共同祖先。LGDV内部存在多个保守位点，如位点1中的解旋酶与甲基转移酶基因对、位点4中的CjLGDV_orf23-pif4-CjLGDV_orf25基因簇，反映了LGDV特有的内部保守基因组织。
多序列比对（MSA）与多重结构比对（MSTA）分析支持LGDV为与AmFV/AmFLV密切相关的单系群： 基于20个保守基因产物的单蛋白系统发育树中，MSA与MSTA分析产生大体一致的拓扑结构，LGDV始终恢复为单系群，AmFV/AmFLV多数情况下被置于最邻近的分支。串联保守蛋白的MSA与MSTA系统发育树同样基本一致，均支持LGDV的单系性并将AmFV/AmFLV定位为姐妹谱系。两种方法的主要差异在于LGDV内部拓扑：MSTA树将LGDV分为Formicinae相关和Myrmicinae相关两个亚支，而MSA树中Formicinae相关LGDV为单系，MoLGDV和PsLGDV依次位于该支之外。谱系距离计算显示，LGDV内部距离落在科内范围内；在MSA树中，LGDV与AmFV/AmFLV的距离接近科内范围上限，而在MSTA树中则超过科内范围，与科间距离重叠。
时间标定系统发育表明LGDV与AmFV/AmFLV之间存在古老分离： 分子定年分析将Lefavirales的最新共同祖先（TMRCA）定于约3.16亿年前，LGDV、AmFV/AmFLV、丝状病毒（filamentovirus）和螫蝇病毒（hytrosavirus）的共同祖先约为3.11亿年前。LGDV与AmFV/AmFLV的分化时间估计为约2.08亿年前（95%最高后验密度区间：1.68–2.50亿年）。此后，LGDV的TMRCA约为1.57亿年，而AmFV与AmFLV的TMRCA约为1.03亿年。这些结果支持LGDV与AmFV/AmFLV之间存在古老分离，符合两者作为不同但相邻谱系并经历长期独立演化的解释。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，通过从系统发育上不同的蚂蚁宿主中鉴定更多LGDV基因组，研究表明LGDV形成了一个内部一致且多样化的蚂蚁相关病毒谱系，可作为AmFV/AmFLV演化定位的比较框架。目前已鉴定的LGDV基因组来自五个蚂蚁物种，长度和基因组成各异，且仅从蚁科成员中回收，但不排除其他膜翅目或更远缘节肢动物中存在LGDV感染的可能性。三个AgLGDV分离株的高全基因组相似性和大范围共线区块，结合Anoplolepis gracilipes的广泛入侵特性，暗示其有限的差异可能反映了近期宿主介导的扩散或奠基者效应。转录组筛查提供了活跃病毒感染的补充证据，但需针对疑似感染群体、个体和组织进行靶向采样。综合多项证据——包括LGDV限制性基因集、谱系特异性保守氨基酸和基因组织、升高的内部AAI值以及序列和结构系统发育中的一致单系位置——支持LGDV属于Lefavirales目中一个新科。Formicinae相关与Myrmicinae相关LGDV在基因组组成和基因组织上的差异表明谱系特异性变化参与了LGDV的多样化。MoLGDV中ODV-E66、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和几丁质结合蛋白的缺失，与这些基因在其他LGDV中的保留形成对比，提示可能的功能分化或差异基因保留。LGDV与AmFV/AmFLV之间共享的保守基因（包括编码结构蛋白的基因）以及缺乏宏观共线性、LGDV限制性基因和氨基酸、谱系距离分离及深度的分子定年结果，共同支持两者为共享Lefavirales祖先但经历长期独立演化的不同古老相邻谱系。LGDV、AmFV/AmFLV、丝状病毒和螫蝇病毒之间的相对近缘关系及其共有的ATP酶同源物，提示这些病毒在naldaviricetes长期多样化过程中差异保留和重组了祖先特征。序列与结构系统发育分析的一致性与互补性，凸显了结构指导方法在解析高度分歧大型dsDNA病毒深层关系中的价值。
研究结论： 本研究的分析支持LGDV作为Naldaviricetes纲Lefavirales目中一个内部一致且深度分化的科级谱系。蜜蜂相关的AmFV/AmFLV谱系的演化位置被确定为LGDV的邻近分支。未来需要进一步的靶向采样和功能研究来全面定义这些病毒的宿主范围、组织嗜性、致病潜力及其与宿主的分子互作，从而拓宽对膜翅目内大型dsDNA病毒多样化的理解。
