《Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects》：Anionic DOPG liposomal biointerfaces modulate physiological heterogeneity in
Lactiplantibacillus plantarum
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摘要：与活细菌细胞相关的软脂质组装体可以形成动态生物界面，其中表面组成、电荷和纳米尺度组织影响细胞-材料相互作用。本研究考察了阴离子型1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（DOPG）脂质体（无论是否负载氟伐他汀）作为外部关联相，对植物乳杆菌（Lacti
摘要：与活细菌细胞相关的软脂质组装体可以形成动态生物界面，其中表面组成、电荷和纳米尺度组织影响细胞-材料相互作用。本研究考察了阴离子型1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（DOPG）脂质体（无论是否负载氟伐他汀）作为外部关联相，对植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）在4°C冷藏储存28天期间生理状态分布的影响。研究人员制备了三种体系：游离细菌细胞（CTRL）、与未负载DOPG脂质体共分散的细胞（B/L），以及与负载氟伐他汀的DOPG脂质体共分散的细胞（B/L/F）。采用流式细胞术结合RedoxSensor Green（RSG）和碘化丙啶（PI）染色评估生理异质性，同时测定细胞还原能力（AlamarBlue（AB）法和MTT法）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性。通过ζ电位、动态光散射（DLS）和冷冻扫描电子显微镜（cryo-SEM）表征胶体性质。结果显示，B/L/F体系在储存中期（第7天和第14天）表现出最高的活性细胞比例（分别为33.80%和31.79%）和最高的活性细胞绝对计数（分别达到8.69×106和4.27×106 objects·mL-1），并在第28天仍保留了可测量的活性细胞群。两种脂质体关联体系均维持了细胞还原能力，并显示出比CTRL更低的GST活性。ζ电位测量表明，脂质体关联体系在储存早期具有更负的表面电荷，而DLS显示其保留了纳米级颗粒分布特征。cryo-SEM观察证实了细菌表面存在囊泡样结构。这些结果表明，阴离子型DOPG脂质体生物界面能够调节植物乳杆菌的生理状态分布，其中负载氟伐他汀的脂质体配方展现出最强的生理调节作用，这可能为开发结合益生菌与生物活性化合物的复合制剂提供了新的策略。
研究背景与目的
益生菌的功能性不仅取决于其存活数量，更与细胞所处的生理状态密切相关。在加工和储存过程中，细菌种群会分化为代谢活跃态、损伤态、休眠态以及活的非可培养态等不同亚群，每种状态对技术功能和生物学功能的影响各异。传统的益生菌稳定化策略主要通过基质层面的包埋来提升存活率，但对细菌表面的物理化学微环境干预有限。近年来，单细胞包封和细菌表面修饰受到关注，认为细胞-材料界面是决定微生物功能的主动因素而非被动保护层。脂质体因其组成和表面电荷可调、能包载亲脂性或水难溶性化合物等优点，成为构建此类界面的理想候选材料。然而，脂质体在益生菌体系中主要被用作保护性载体或包封系统，其通过外部界面关联方式调节细菌生理状态的潜力尚不清楚。
本研究旨在探讨阴离子型1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（DOPG）脂质体作为外部关联相，对植物乳杆菌在4°C冷藏储存28天期间生理状态分布的影响。同时引入氟伐他汀作为代表性亲脂性生物活性化合物，考察脂质体组成变化对细菌生理行为的影响。研究假设脂质体相的存在和组成会与不同的活性、损伤、休眠和死亡细胞分布相关联，并伴随细胞还原能力和应激相关酶活性的差异。
主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：利用薄膜水化法制备DOPG脂质体，并通过挤出和凝胶过滤纯化获得尺寸均一的脂质体分散液；采用流式细胞术结合RedoxSensor Green（RSG）和碘化丙啶（PI）双染法，将细菌分为活性、损伤、休眠和死亡四个生理亚群；通过AlamarBlue（AB）法和MTT法测定细胞整体还原能力；检测谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性作为应激相关解毒反应的指标；利用电泳光散射法测定ζ电位和动态光散射（DLS）分析表观粒径分布；采用冷冻扫描电子显微镜（cryo-SEM）观察体系形态和表面组织。所有实验基于五个独立生物学重复，每个重复进行三次技术重复，数据采用单因素方差分析（ANOVA）结合Holm-?idák事后检验进行统计分析。
研究结果
3.1 DOPG脂质体重塑植物乳杆菌在冷藏期间的生理状态分布
流式细胞术揭示了体系依赖性的生理状态再分布。在游离细胞对照（CTRL）中，损伤和死亡细胞始终占主导地位，活性细胞比例极低（第1天为1.33%，第28天降至0.17%）。与未负载DOPG脂质体共分散的体系（B/L）在储存中期（第7天和第14天）活性细胞比例显著升高至11.87%和20.93%，死亡细胞比例保持在较低水平（约10%），但到第28天活性细胞下降至2.87%。与负载氟伐他汀的DOPG脂质体共分散的体系（B/L/F）展现出最强的生理状态调节作用，活性细胞比例从第1天的7.62%升至第7天的33.80%和第14天的31.79%，损伤细胞比例始终低于CTRL。绝对计数进一步证实B/L/F在第7天和第14天拥有最高的活性细胞数量（8.69×106和4.27×106 objects·mL-1），并在第28天保留了3.54×105 objects·mL-1的活性细胞。
3.2 界面依赖性细胞还原能力变化
AlamarBlue（AB）还原实验显示体系间存在不同的变化轨迹。B/L在第1天即表现出高于CTRL的还原能力（121.05%），并从第7天起持续维持在较高水平。B/L/F在第1天的AB还原能力低于CTRL（82.70%），但从第7天起逐渐回升，最终在第28天超过CTRL。MTT实验结果支持这一趋势，两种脂质体关联体系均在储存后期展现出维持或增强的还原能力，表明脂质体关联并未导致还原功能丧失。
3.3 脂质体关联降低冷藏期间的GST相关应激反应
谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性测定显示，CTRL在大多数时间点具有最高的GST活性，表明游离细胞经历了更强的解毒相关应激反应。两种脂质体关联体系的GST活性在整个储存期间均显著低于CTRL，其中B/L/F在第1天具有最低的初始活性，但在第14天出现适度升高并略高于B/L，但仍低于CTRL。这表明脂质体界面可能降低了细菌的解毒需求，而氟伐他汀的存在赋予了体系独特的应激响应特征。
3.4 表面静电学和粒径分布支持外部脂质体组织
ζ电位测量显示，脂质体关联体系在储存早期（第1天和第7天）具有比CTRL更负的表面电荷，这与阴离子型DOPG脂质相的贡献一致。随着储存时间延长，各体系ζ电位趋于收敛。动态光散射（DLS）分析表明，CTRL的粒径分布随时间推移向更大尺寸区域移动，而B/L和B/L/F则在整个储存期内维持了以纳米级颗粒为主的分布特征，即使在36.6°C测量条件下也保持这一趋势。这提示脂质体关联体系保持了纳米尺度的胶体组织。
3.5 冷冻扫描电镜显示细菌表面存在囊泡样结构
冷冻扫描电子显微镜（cryo-SEM）观察显示，CTRL细胞呈现典型的杆状形态，表面无可见囊泡结构。而在B/L和B/L/F体系中，球形囊泡样纳米结构出现在细胞附近和细胞包膜表面或紧邻处，呈现不均匀的周细胞分布，而非连续包壳。这表明脂质材料以外部关联的方式存在于细菌表面。
3.6 连接DOPG脂质体关联与生理状态调节的界面模型
综合各项结果，研究人员提出了一个界面模型：在CTRL中，缺乏脂质体界面导致细胞向损伤、休眠和死亡状态转化，活性细胞减少，GST活性升高；在B/L中，未负载DOPG脂质体与更负的早期ζ电位、纳米级颗粒保留、降低的GST活性以及储存中期活性细胞的短暂富集相关联；B/L/F展现出最强的生理状态调节作用，包括活性细胞的最大富集和可测量活性细胞群的晚期保留。该模型将脂质体关联、氟伐他汀的使用、表面静电学、纳米尺度胶体组织和应激相关响应与植物乳杆菌生理状态的体系依赖性再分布联系起来，但未提供分子信号通路或特定细胞内靶点的直接证据。
总结与结论
本研究表明，DOPG脂质体关联能够调节植物乳杆菌在冷藏期间的生理状态分布。脂质体关联体系重新分配了活性、损伤、休眠和死亡细胞的比例，维持了细胞还原能力，并显示出比游离细胞更低的GST活性。其中，负载氟伐他汀的DOPG脂质体在储存中期展现出最强的活性细胞富集效果，并在后期保留了可测量的活性细胞群。ζ电位、表观粒径分布和cryo-SEM观察支持外部关联模型，表现为不均一的周细胞脂质体相而非连续包壳。B/L/F配方将纳米尺度界面组织与细菌生理状态的调节联系起来。这些效应应被视为界面组织与生理调节之间的关联，而非特定信号通路或细胞内靶点的直接证据。未来研究需阐明脂质体-细胞相互作用的分子基础、氟伐他汀的命运以及在应用相关条件下的性能表现。
