《Microbiology Spectrum》：Development and optimization of self-collected, field-stable, saliva-based immunoassays for scalable epidemiological surveillance of pathogen-specific immunity
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血清学监测（serological surveillance）是传染病研究与循证公共卫生决策的基础。针对病原特异性免疫（pathogen-specific immunity）的免疫分析方法（immunoassays）历来依赖静脉采血（venous blood
血清学监测（serological surveillance）是传染病研究与循证公共卫生决策的基础。针对病原特异性免疫（pathogen-specific immunity）的免疫分析方法（immunoassays）历来依赖静脉采血（venous blood collection）。该方法在许多公共卫生应用中至关重要，但具有侵入性且资源消耗大。在资源有限地区，静脉采血相关的成本与后勤障碍更为突出，而转向侵入性更低的采样方法将提高用于病原监测与病原特异性免疫研究的样本可及性。为此，研究人员开发并优化了一种自采集、基于唾液（saliva-based）的免疫分析方法，能够定量检测唾液样本中病原特异性抗体的结合水平。利用采集自全球地理与流行病学特征多样地区的样本，研究人员比较了配对血浆（plasma）与唾液样本中的抗原特异性IgG水平。观察发现，针对多种公共卫生关注病原体——包括SARS-CoV-2与登革病毒（dengue virus）——的IgG水平在血浆与拭子采集唾液（swab-collected saliva）中高度相关。此外，利用该免疫分析方法可直观观察到婴儿唾液样本中母体来源抗体（maternally derived antibodies）的衰减，证明该方法的灵敏度及其在测量抗体动力学（antibody kinetics）方面的潜力。研究人员认为，该方法代表一种气候稳定（climate-stable）、非侵入性的工具，可在广泛的公共卫生适应症中助力病原特异性免疫的监测与研究。
研究背景方面，血清学监测是传染病流行病学的基石，可为关键公共卫生决策提供依据，并能揭示病原传播的历史与持续模式。传统上，该分析依赖血清学检测，需静脉采血并随后分离血浆或血清，用于ELISA（酶联免疫吸附试验）、体外中和试验（in vitro neutralization assays）及多重抗原阵列（multiplex antigen arrays）等检测。血清与血浆虽是病原特异性抗体的稳健可靠来源，但从婴儿、幼儿、老年人及急性病患者采集静脉血在后勤上颇具挑战；即使健康成年志愿者，采血频率亦受限，因为需要受过训练的专业采血人员（phlebotomists），且研究参与者可能需同意反复采血。此外，血液样本须以对温度和时间的敏感方式正确保存与处理，这同样成本高昂，需训练有素的人员在最大化样本稳定性的时限内完成采集、运输与处理。高频与纵向采样对准确的血清学解读和/或近期病原感染检测往往至关重要。这些挑战对于抗原相关的病原体尤为突出，例如正黄病毒（orthoflaviviruses），登革病毒（DENV）血清型、寨卡病毒（ZIKV）、日本脑炎病毒（JEV）与黄热病毒（YFV）之间存在广泛的免疫交叉反应（immunologic cross-reactivity），可混淆对暴露史与免疫状态的解读。量化这些复杂且交叉反应性免疫谱的发生与演化并评估其与感染和/或重症风险的关系仍具挑战，尤其受血液样本采集后勤限制的影响。近年来唾液检测取得进展，全球SARS-CoV-2大流行加速了唾液PCR与快速抗原检测的开发。唾液与血浆均被用于追踪儿科队列的SARS-CoV-2流行病学研究。近年已开发出用于检测HIV、某些癌症标志物、牙齿疾病及可致胃溃疡细菌的唾液检测。唾液采集侵入性最小，对研究团队人员培训要求极低，可由志愿者在家完成，并可在环境温度下保存于稳定缓冲液中，从而在不影响样本质量的前提下延长采集与处理之间的时间间隔。病原体与宿主的RNA和DNA均可从唾液样本中提取，IgG与IgA抗体应答亦可便捷测定。唾液IgG的组成与血清IgG高度匹配，尽管浓度较低。值得注意的是，可采用基于拭子的采集方法，优先从龈沟液（crevicular fluid）中采集唾液，此处唾液IgG最能反映血清IgG。因此研究人员系统评估了一种自施行的、免冷链（cold-chain-free）、基于拭子的唾液采集策略，靶向龈沟液以定量病原特异性IgG应答。为此，研究人员采集配对血浆与唾液样本，在具有地理与流行病学差异的队列间比较总IgG及抗原特异性IgG水平。
在技术方法上，唾液采用OraSure口腔液体采集装置（OraSure Oral Fluid Collection Device），采集垫置于牙龈与下颊之间龈沟处2–5分钟，折断入含稳定缓冲液的标本瓶保存，处理时离心收集，?80°C保存，所有志愿者采集前禁食、禁饮、婴儿禁哺乳。静脉血以EDTA管采集并在16小时内处理，离心分离血浆，?80°C保存。样本队列来源包括：纽约州锡拉丘兹（Syracuse, NY）初步验证队列；SUNY Upstate Medical University医护人员2024–2025呼吸道病毒季前瞻性监测队列（COVID employee surveillance study）；以及泰国Kamphaeng Phet多代家庭纵向队列（Kamphaeng Phet family cohort study），含母婴配对每月唾液采集。总人IgG采用Human IgG Total Uncoated ELISA Kit（Invitrogen）测定，唾液先1:50稀释，超范围再1:200稀释。SARS-CoV-2免疫分析采用Meso Scale Discovery（MSD）平台试剂盒，检测针对spike、nucleocapsid与RBD抗原的IgG，血浆1:10,000、唾液1:50稀释。DENV 1–4 NS1免疫分析基于MSD U-Plex Development Pack（7-assay）定制，将重组DENV-1至DENV-4 NS1（Native Antigen）生物素化后按1:1:1:1等摩尔混合，偶联MSD连接蛋白包被96孔板，血浆1:1,000、唾液1:5稀释。统计分析与可视化采用R（version 4.5.2）与RStudio（version 2025.09.2+418）。需说明唾液稳定介质与活细胞不兼容，故不能用于细胞中和试验。
研究结果方面：（1）唾液作为病原特异性IgG来源的评估：与既往报道一致，入组唾液总IgG水平显著低于配对血浆但仍稳定。用多重免疫分析测定SARS-CoV-2 spike、RBD与nucleocapsid蛋白的IgG结合，配对血浆与唾液抗原特异性IgG在所有三种抗原上均呈显著正相关（Pearson = 0.867，Spearman = 0.81）；按总IgG归一化后相关性仍显著为正（Pearson = 0.869，Spearman = 0.824），表明尽管唾液总IgG较低，抗原特异性抗体在唾液样本中仍被稳健呈现。连续5天每日自采唾液检测显示日间波动虽存在但均低于两倍，各抗原RMS-CV为RBD = 72.3、spike = 72.9、nucleocapsid = 78.4，表明重复采样结果相对稳定一致。进一步利用SUNY Upstate呼吸道病毒监测研究疫苗接种前后配对唾液样本，抗nucleocapsid抗体均值倍数变化低于两倍（配对t检验 P = 0.612），符合不含nucleocapsid抗原疫苗的预期；而接种后抗spike唾液IgG丰度增加2.9倍（配对t检验 P = 0.005），表明疫苗诱导的抗spike免疫应答可在人唾液样本中测得。（2）多代家庭队列研究中唾液作为病原特异性IgG来源的评估：在0至80岁人群（n = 263）中，未按总IgG校正时抗原特异性唾液IgG与血浆IgG强相关（Pearson = 0.745，Spearman = 0.742），校正后相关性维持（Pearson = 0.748，Spearman = 0.762）。滑动窗口相关分析显示唾液与血浆SARS-CoV-2特异性IgG滴度的相关性不随年龄显著变化，且是否按唾液总IgG校正对该关系无显著影响（Fisher's Z检验 P = 0.872）。观察到唾液IgG针对nucleocapsid、RBD与spike抗原随年龄的变化趋势，抗spike与RBD IgG自出生至25岁上升，而抗nucleocapsid IgG在各年龄组保持稳定，与疫苗接种诱导针对spike与RBD抗原抗体一致，按总IgG校正后趋势相同。（3）唾液作为DENV特异性IgG来源：研究人员开发pan-DENV IgG检测，采用DENV-1至-4 NS1抗原等摩尔混合，在Kamphaeng Phet家庭队列子集（n = 92）中观察到抗DENV唾液与血浆IgG显著相关，未校正（Pearson = 0.917，Spearman = 0.908）与校正总IgG（Pearson = 0.93，Spearman = 0.921）均如此；滑动窗口相关分析表明按总IgG校正未增加该关系在广泛年龄范围内的统计学显著性。与泰国Kamphaeng Phet已知DENV流行病学一致，观察到该队列个体DENV特异性IgG水平随年龄上升，支持利用唾液定量抗DENV抗体并捕捉随年龄与暴露变化的抗体水平。（4）唾液IgG采集可捕捉婴儿母体抗体衰减：利用三个母婴配对唾液样本测定针对SARS-CoV-2抗原与DENV 1–4 NS1的IgG，发现出生时母婴唾液抗原特异性IgG水平高度相关，符合婴儿脐带血抗体的母体来源；对出生后4–5个月内婴儿唾液样本定量显示抗原特异性IgG随时间显著衰减，其模式与速率符合出生后母体抗体丢失；而母亲体内相同抗体水平保持恒定，另有一名未能完成全程纵向配对采样但至少有两个母体时间点的母亲亦如此，进一步表明可利用在家采集的婴儿唾液样本量化母体抗体衰减。
讨论部分总结：基于唾液的免疫分析为传统血液血清学检测提供了有前景的替代方案，可解决大规模与纵向血清流行病学研究的若干持续障碍。本文数据表明，靶向龈沟液的自施行（或幼儿由成人协助采集）拭子唾液采集策略可在多样人群与环境中可靠定量病原特异性IgG应答。唾液作为诊断工具在多方面具吸引力：侵入性最小，仅需将海绵状拭子置于颊部近牙龈处2分钟；相比血液样本更具成本、时间与人力效益，后者需训练有素人员与无菌设备，常依赖临床人员或受试者出行采样；血液样本完整性在特定气候下难以维持，温度与至处理的时间等因素可影响样本质量；在被忽视热带病流行区，血液采样与处理所需资源与基础设施并非总能获得。唾液采样无需人员或临床访视，自采或家长代采样本可在缓冲液中稳定并于宽泛环境温度范围内保存，且约每2小时可舒适获得重复样本，唯一注意事项为近期进食或饮水、使用口香糖、含片或烟草制品及口腔卫生操作。频繁非侵入性采样为未来研究设计带来诸多可能，该平台的不可知性（agnostic nature）允许定制目标抗原。对于DENV等正黄病毒，频繁采样可能有助于捕捉占全球DENV感染大部分的亚临床感染（subclinical infections）；亚临床DENV感染的动力学与效应尚未完全阐明，但其促进人群内DENV传播并在疫苗设计中需予考虑；抗DENV抗体衰减率的数学建模提示以3个月间隔采样可提高捕捉亚临床感染的可能性，而以此频率获取血液样本困难，转向唾液等侵入性更低的居家采样方法或可填补数据空白。DENV特异性免疫定量因多种DENV血清型与抗原相关病毒（如ZIKV、JEV、YFV）在许多地区共循环而复杂，回顾性血清学推断近期DENV感染具挑战，最好通过频繁采样实现，而这正是唾液分析所赋能的。该唾液平台可应用于其他病原体，甚至以快速检测形式。作者同时指出，本研究并非首个描述唾液定量DENV特异性IgG以规避静脉采血的方法，既往研究采用咳出与拭子采集法，但与血液方法相关性仅中等，尤其在识别既往正黄病毒感染时；作者认为本报告方法显著优于既往研究，在于联合使用靶向龈沟液的采集拭子与蛋白稳定溶液（显著改善采集后IgG的回收与稳定性），以及可补偿唾液较血浆或血清IgG浓度更低的高灵敏度终点检测。研究局限性包括：Kamphaeng Phet家庭队列近期才实施唾液采集，可用于分析的唾液样本有限；母婴配对分析同样受限，随更多配对入组将延续每月采样；母婴配对采样的重要考虑是距哺乳时间，因母体抗体可经母乳直接进入口腔，故若检测IgG以外同种型需谨慎，而本研究中工作人员协助母婴唾液采集以控制这些变量；技术上，用于采集与保存唾液的稳定介质与活细胞不兼容，故本研究所采集唾液内容物不能用于基于细胞的中和试验和/或任何需活细胞的检测。研究结论：研究人员认为，基于唾液的免疫分析代表一种低成本、非侵入性的替代方案，可替代传统血液检测用于抗病原免疫的定量与纵向评估，本文所述方法代表了成功实施这一有前景技术的显著进步。未来希望继续利用该唾液平台研究正黄病毒免疫，重点关注亚临床DENV感染，并计划将免疫分析扩展至包括ZIKV与JEV等共循环相关正黄病毒，以研究序贯感染与免疫史对后续感染和疫苗接种的影响。
