《Microbiology Spectrum》：Adjunctive recombinant human thymosin β4 therapy improves antibacterial outcomes against Staphylococcus aureus
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胸腺素β4（Tβ4）是一种内源性多功能蛋白，在包括感染性疾病在内的治疗应用中日益广泛；然而，其内在抗菌活性仍不明确。既往针对该多肽及其相关贝类同源物的研究提示其具有广谱抗菌特性，包括对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的
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胸腺素β4（Tβ4）是一种内源性多功能蛋白，在包括感染性疾病在内的治疗应用中日益广泛；然而，其内在抗菌活性仍不明确。既往针对该多肽及其相关贝类同源物的研究提示其具有广谱抗菌特性，包括对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的活性。本研究评估了重组人胸腺素β4（rhTβ4）单独使用及与抗生素联用对金黄色葡萄球菌8325-4菌株及两株临床分离株的抗菌活性。研究人员通过肉汤微量稀释法和菌落形成单位计数评估了rhTβ4（15.625–16,000 μg/mL）的直接抗菌活性。采用棋盘法检测评估rhTβ4与抗生素之间的相互作用，分别考察总菌群、浮游菌群及生物膜相关菌群。进一步采用结晶紫染色和SYTO9/PI标记分别评估生物膜生物量和膜完整性。评估的抗生素包括莫西沙星、环丙沙星、苯唑西林和万古霉素。rhTβ4单独使用仅表现出温和的生长调节作用，缺乏实质性直接抗菌活性。相比之下，rhTβ4与多种抗生素表现出协同相互作用，主要降低总菌群和浮游菌群中的细菌生长。对已形成的生物膜作用有限，rhTβ4未能显著降低生物膜生物量或膜完整性，联合治疗产生的生物膜反应呈抗生素依赖性。综上，这些发现表明rhTβ4对金黄色葡萄球菌几乎无内在抗菌活性，但可在体外协同增强特定抗生素的效果，支持其作为辅助治疗策略的应用价值。
论文解读
一、研究背景与目的
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是全球范围内导致严重感染的主要病原体之一，涉及心内膜炎、多种皮肤感染、肺炎、骨髓炎、角膜炎和脑脓肿等多种疾病。2019年的数据显示，该菌在135个国家中被认定为致死性最高的细菌性病原体，全球范围内与超过一百万例死亡相关。尽管金黄色葡萄球菌是人类微生物组的正常组成部分，其感染相关的发病率和死亡率仍然居高不下。治疗金黄色葡萄球菌感染面临多重挑战，包括生物膜形成、抗生素耐药、抗生素渗透性差以及免疫逃逸机制等，这些因素促使研究者日益关注免疫调节性辅助治疗策略。
胸腺素β4（Thymosin beta-4, Tβ4）是一种在除红细胞外的几乎所有细胞类型中表达的小分子内源性多肽，以其在伤口愈合和组织修复中的作用而闻名。作为重组人蛋白（recombinant human, rh），rhTβ4目前正在心肌梗死、干眼症和压疮等疾病的临床试验中接受评估，并在多种感染性疾病的临床前模型中显示出治疗潜力。外源性给予Tβ4在铜绿假单胞菌角膜炎和病毒性肝炎模型中改善了疾病结局，异位表达在军团病中也通过增强病原体清除、免疫调节和组织修复而显示出益处。值得注意的是，内源性Tβ4表达单独似乎不足以有效解决感染，治疗获益始终需要外源性补充。
然而，rhTβ4是否具有直接的抗菌活性仍不明确。早期研究曾报道rhTβ4对铜绿假单胞菌具有抗菌活性，对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌作用较弱，但该研究采用了非标准的抗菌药敏试验方法，后续复制尝试未能证实其对铜绿假单胞菌的显著抗菌活性。相比之下，Tβ4的贝类同源物、人Tβ4的9-19片段以及源自人血小板的Tβ4均表现出对金黄色葡萄球菌的广谱抗菌活性。这些发现提出了rhTβ4是否对金黄色葡萄球菌具有内在抗菌活性的关键问题。鉴于Tβ4已确立的免疫调节特性和在感染中新兴的治疗潜力，评估其直接抗菌活性对于理解其整体治疗价值至关重要。
二、研究设计与方法
本研究系统评估了rhTβ4对金黄色葡萄球菌8325-4实验室菌株及两株临床分离株（DMC-1和DMC-2，由底特律医学中心提供，均对测试抗生素敏感）的抗菌潜力及其与抗生素的协同能力。研究采用的主要技术方法包括：肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）；菌落形成单位（colony-forming unit, CFU）计数法量化细菌载量；棋盘法（checkerboard assay）评估Tβ4与四种临床常用抗生素——莫西沙星、环丙沙星、苯唑西林和万古霉素——的联合效应，分别针对总菌群、浮游菌群和生物膜相关菌群；结晶紫染色法评估生物膜生物量；SYTO 9/PI荧光染色法评估生物膜内细菌的膜完整性；最高单药活性（Highest Single Agent, HSA）评分量化协同或拮抗作用。
三、研究结果
Tβ4对金黄色葡萄球菌具有轻微的生长调节作用
通过肉汤微量稀释法在浮游和生物膜亚群中评估了Tβ4（0–16,000 μg/mL）的抗菌活性。在测试浓度范围内未检测到MIC，表明Tβ4对金黄色葡萄球菌不具有实质性内在抗菌活性。在浮游培养中，Tβ4产生轻微的菌株依赖性生长抑制作用：8325-4菌株在16,000 μg/mL时最大减少0.78 log?? CFU/mL；DMC-1在最高浓度时最大减少0.97 log?? CFU/mL；DMC-2仅表现出微小且非浓度依赖性的减少。生物膜相关细菌对Tβ4暴露相对不变，所有菌株的变化均小于0.31 log?? CFU/mL且缺乏明确的浓度-反应关系。
辅助性Tβ4增强抗生素对总菌群的活性
棋盘法结果显示，Tβ4与四种抗生素联用时，总菌群生长百分比呈浓度依赖性下降趋势。HSA评分显示莫西沙星表现出最强且最广泛的协同作用，在1/16 MIC和4,000 μg/mL Tβ4时达到最高协同评分22.33；万古霉素在各组合中表现出一致的中至强协同作用（HSA评分10–18范围），最高HSA为18.51，出现在1/4 MIC和1,000 μg/mL Tβ4；苯唑西林的HSA评分峰值约33，在低至中浓度抗生素和高浓度Tβ4区域表现出强效但范围较窄的协同作用；环丙沙星表现相对温和，峰值HSA为20.15。各抗生素与Tβ4组合中的拮抗作用极少，仅作为孤立异常值出现。
辅助性Tβ4增强抗生素对浮游菌群的活性
针对浮游亚群的棋盘法分析显示，Tβ4与抗生素联用时浮游菌生长随Tβ4浓度增加呈下降趋势。莫西沙星在1/8 MIC和250 μg/mL Tβ4时达到最强协同效应（HSA = 29.87）；苯唑西林在1/8 MIC和16,000 μg/mL Tβ4时达到最大协同（HSA = 38.59），其协同活性比总菌群更广更强；万古霉素在1/16 MIC和2,000 μg/mL Tβ4时峰值HSA为21.04，在1/2 MIC附近观察到少量拮抗作用，可能反映实验变异性；环丙沙星在1/16 MIC和125 μg/mL Tβ4时达到最大协同（HSA = 38.93），未观察到显著拮抗。
辅助性Tβ4对生物膜生物量产生抗生素依赖性效应
结晶紫染色结果显示各抗生素对生物膜相关细菌表现出不同的浓度依赖性效应。莫西沙星抗生物膜活性较弱，即使在1/2 MIC时生物膜仍大量存留（91.08%生长）；环丙沙星在1/2和1/4 MIC时分别表现出强和中度抑制，但在1/8和1/16 MIC时反而使生物膜形成分别增加21%和36%；苯唑西林表现出最强的抗生物膜效力，即使在低浓度（1/8 MIC时7.67%）也能将生物膜降至最低水平；万古霉素表现出中度抗生物膜活性。Tβ4单独使用产生可变效应，在8,000 μg/mL时一致性地增加生物膜生物量。HSA评分显示，莫西沙星与Tβ4联用表现出显著拮抗（最大拮抗HSA = ?85.73）；苯唑西林总体呈中性相互作用；环丙沙星和万古霉素则同时表现出协同和拮抗结果，协同作用主要与较高Tβ4浓度相关。总体而言，生物膜相互作用模式更多由抗生素本身特性驱动而非Tβ4。
辅助性Tβ4对生物膜细菌膜完整性产生抗生素依赖性效应
SYTO 9/PI染色结果显示，Tβ4单独处理未显著改变绿色/红色荧光比值，表明Tβ4不直接破坏已形成生物膜内的细菌膜。与莫西沙星和苯唑西林联用时同样观察到无效效应。然而，与环丙沙星联用时，低至中浓度Tβ4显著降低绿色/红色比值，表明膜损伤增加，但这些变化并未转化为生物膜负荷的减少；在最高浓度（16,000 μg/mL）时，联合治疗虽降低生物膜生物量但残余菌群富集了膜完整细胞。与万古霉素联用时也观察到类似模式：低浓度Tβ4降低绿色/红色比值，而16,000 μg/mL时生物膜生物量大幅减少但绿色/红色比值升高。这些发现表明Tβ4以抗生素依赖性方式调节生物膜相关细菌的生理状态，而非直接发挥膜破坏或抗菌活性。
辅助性Tβ4增强抗生素对临床分离株的活性
对两株临床分离株的棋盘法分析显示，辅助性Tβ4在多种抗生素组合中降低了细菌生长，效应幅度因抗生素类别、菌株和浓度而异。亚MIC抗生素浓度下的生长减少最为明显，而达到或超过MIC的组合因已有显著生长抑制而获益有限。对DMC-1，万古霉素表现出最强且最一致的协同相互作用，莫西沙星和环丙沙星则表现出协同、中性和偶发拮抗的混合反应，苯唑西林以非相互作用为主。对DMC-2，环丙沙星和万古霉素表现出最广泛的协同作用，莫西沙星协同活性可观但范围较窄，苯唑西林则根据抗生素与Tβ4浓度比表现出拮抗、中性和协同的混合模式。
四、讨论与结论
本研究揭示了rhTβ4对金黄色葡萄球菌的治疗价值主要不在于直接抗菌活性，而在于其作为抗生素疗效的依赖性增强因子。临床相关浓度的Tβ4（100、300和1,000 μg/mL为常用局部给药浓度）对金黄色葡萄球菌表现出极小的直接抗菌活性，但能增强多种抗生素对浮游菌群的抗菌效果。与既往报道相比，本研究观察到的rhTβ4直接抑菌作用弱于黄氏等和Tang等报道的血小板来源Tβ4的作用，这可能反映方法学差异或表明血小板来源的Tβ4具有更强的内在抗菌活性。值得注意的是，多种无脊椎动物Tβ4同源物表现出显著更强的抗菌效力，如来自牡蛎的Tβ4同源物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC仅为25 μg/mL，来自虾的Tβ4同源物MIC仅为5 μg/mL，提示抗菌活性可能是Tβ4家族的保守特征，但活性强度在不同物种间差异显著。
关于生物膜相关细菌，本研究所用浓度均为亚抑制浓度，而生物膜对抗菌治疗的固有耐受性较浮游细胞高出10至1,000倍，这解释了Tβ4对生物膜生物量影响有限的原因。亚抑制浓度抗生素可能通过激活细菌应激反应通路反而促进生物膜形成，这一现象在环丙沙星处理中被观察到。生物膜生物量与膜完整性测量之间的不一致性提示Tβ4可能影响生物膜相关细菌的生理状态而不直接影响整体生物膜积累，潜在机制可能包括调节细菌应激反应、改变膜稳态、影响代谢活性或改变生物膜结构。
本研究的主要局限性在于体外实验无法完全评估Tβ4与抗生素在抑制浓度下的相互作用，无法模拟宿主-病原体相互作用、生理盐浓度、内源性抗菌肽等可能影响体内治疗反应的因素。结论认为，临床相关浓度的rhTβ4能显著增强多种抗生素对金黄色葡萄球菌的活性，补充其已确立的免疫调节和伤口愈合功能，支持这些发现的转化相关性。未来需要利用金黄色葡萄球菌感染的动物模型来确定体外观察到的抗生素增强效应能否与Tβ4的免疫调节和伤口愈合作用互补，从而改善感染结局。
