《mSphere》：Identification of a novel equine rotavirus B from Missouri in 2025, which is distantly related to group B rotaviruses
编辑推荐：
尽管B组轮状病毒（rotavirus B, RVB）在动物与人群中广泛流行，但直至2021年美国肯塔基州才首次在马的样本中发现RVB。对于RVB在这一新宿主中的遗传多样性与进化规律，目前所知甚少。本研究描述了1株分离自美国密苏里州1匹特发性腹泻驹的马源轮状病
尽管B组轮状病毒（rotavirus B, RVB）在动物与人群中广泛流行，但直至2021年美国肯塔基州才首次在马的样本中发现RVB。对于RVB在这一新宿主中的遗传多样性与进化规律，目前所知甚少。本研究描述了1株分离自美国密苏里州1匹特发性腹泻驹的马源轮状病毒B（equine rotavirus B, ERVB），命名为MO-ERVB-25。全基因组测序（full-genome sequencing）与系统发育分析（phylogenetic analysis）显示，MO-ERVB-25与所有已知的B组轮状病毒均呈远缘关系，其中包括2021年在肯塔基州鉴定的ERVB毒株（KY-ERVB-21）。VP4节段的平均核苷酸替换率估计为1.44 × 10?3 替换/位点/年，比VP7节段高一个数量级。研究进一步证实，MO-ERVB-25与人类RVB相似，可结合化学中性的含LacNAc的复杂N-连接聚糖（complex N-linked glycans）；而KY-ERVB-21则识别带负电荷、以α?2,8-连接的唾液酸聚糖（polysialic acid, polySia），该聚糖亦为不相关的肠道人类腺病毒52型（human adenovirus 52）的功能性受体。借助AlphaFold结构预测（structure prediction）发现，MO-ERVB-25与人类RVB的VP8*均缺乏仅在KY-ERVB-21 VP8*中观察到的新型C端α2螺旋，这或可解释二者聚糖结合特异性的差异。最后，采用逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）对驹样本进行筛查，在特发性驹腹泻样本中检出4.2%（140份中6份）为MO-ERVB-25阳性。上述结果提示，MO-ERVB-25代表在驹中循环的一个新的RVB亚群；其与KY-ERVB-21亚群共同循环，提示基因重配（reassortment）与抗原转变（antigenic shift）可能作为RVB在马属动物中进化的机制。
## 论文主体解读
**一、研究背景与科学问题**
轮状病毒（rotaviruses, RVs）是人与动物胃肠炎的主要致病病原，常伴腹泻，对同一健康（one health）构成重大威胁。RV为三层二十面体颗粒，含11个双链RNA基因组节段，编码6个结构蛋白（VP1–4、VP6、VP7）与5个非结构蛋白（NSP1–5/6）；依据高度保守的VP6中间衣壳蛋白的抗原与遗传差异，RV被划分为9个种（A–D、F–J）。在马属动物中，马源轮状病毒A（equine rotavirus A, ERVA）自20世纪80年代初以来一直是主要关注对象，针对妊娠母马的免疫策略可通过母源抗体转移为驹提供显著保护，但该疫苗仅针对ERVA，对马源轮状病毒B（ERVB）无保护作用，构成本领域防控的重要局限。ERVB直至2021年才在美国肯塔基州被首次鉴定，此后在多个产驹季节持续传播；然而关于ERVB的基因型星座（genotypic constellation, GC）、基因组多样性与进化起源的信息仍十分不足，迄今在马中仅鉴定出单一基因型。鉴于猪与牛宿主中RVB多样性极高，有必要通过持续监测深入探究马中RVB的遗传多样性。此外，RVB的全基因组分类体系尚在建设中，RCWG已为RVA与RVC建立完善分类体系，而RVB仍沿用Shepherd等提出的76%–83%核苷酸同源性阈值，且鼠、人、牛、山羊与猪RVB的GC已建立，马源RVB的GC因毒株有限而尚未阐明，这成为理解ERVB进化、遗传多样性、宿主适应与流行病学的重要障碍。
**二、研究开展与主要结论**
研究人员针对密苏里州1匹5周龄、持续腹泻超过1周的驹，在其常规驹肠道病原RT-qPCR检测（包括艰难梭菌、产气荚膜梭菌、胞内劳森菌、波托马克马热、沙门菌、马冠状病毒、ERVA、ERVB（KY-ERVB-21）与隐孢子虫）均为阴性的情况下，采用无偏宏基因组测序（metagenomic sequencing）鉴定出一株遗传上独特的ERVB，命名为RVB/Horse-wt/USA/MO-Foal01/2025（MO-ERVB-25）。全基因组与系统发育分析表明，该毒株与既往已知RVB远缘相关，在几乎所有节段上均形成独立分支，核苷酸同源性处于或低于所提出的RVB基因型阈值下限，提示其代表一个新的RVB亚群与新的基因型星座；其与KY-ERVB-21在VP8*受体结合域上的序列与结构差异，以及所识别聚糖类别的完全不同，提示二者在受体结合与抗原景观上存在功能分化。基于VP7的RT-qPCR筛查在140份特发性驹腹泻样本中检出6份（4.2%）阳性，而187份牛腹泻样本均为阴性。研究结论为：MO-ERVB-25代表一个在驹中循环的新RVB亚群；其与KY-ERVB-21亚群的共同循环，提示基因重配与抗原转变可能作为RVB在马属动物中进化的机制。该发现拓展了ERVB的遗传多样性，凸显了持续分子监测、改进分子诊断方法以及建立稳健的马源RVB分类体系的必要性。
**三、主要关键技术方法**
研究采用Illumina平台的下一代测序（next-generation sequencing, NGS）进行宏基因组测序，经CLC Workbench从头组装并用BLASTX分析；对粪便样本进行负染透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察；基于VP6与VP7基因设计引物探针，建立一步法RT-qPCR并借助体外转录RNA标准品进行病毒载量定量；对全部11个节段开展BLASTn/BLASTp比较，并以MEGA X的MUSCLE比对与最大似然法（1,000次bootstrap）构建系统发育树，按Shepherd等标准进行基因型划分；采用BEAST v10.5（100 million MCMC步、不相关松弛钟、恒定种群树先验）估算进化速率与最近共同祖先时间（time to the most recent common ancestor, tMRCA）；以AlphaFold（经ChimeraX）预测结构并与人类RVB VP8*实验晶体结构（PDB ID: 7RSW）进行基于结构的比对，计算相对溶剂可及表面积（relative solvent accessible surface area, RelSASA）并用ElliPro预测线性与不连续表位；以GST-VP8*融合蛋白在糖芯片（glycan array）上分析聚糖结合特异性。样本队列来源为：密苏里州1匹患病驹的粪便样本，南达科他州立大学动物疾病研究与诊断实验室的187份牛粪便拭子样本，以及肯塔基大学兽医诊断实验室提供的140份常见肠道病原检测阴性的腹泻驹RNA样本。
**四、研究结果**
**1. 从密苏里州1匹腹泻驹中鉴定出一株新型RVB毒株。** 常规马腹泻检测组合RT-qPCR未检出任何致病病原；宏基因组测序在全部11个病毒基因组节段上均显示与RVB的序列相似性，且未检出其他已知肠道病毒病原，该病毒被命名为MO-ERVB-25。TEM在粪便样本中观察到直径约100 nm、形态与RV一致的颗粒；因样本量有限未进行纯化病毒制备的图像采集。宏基因组分析与TEM结果共同支持该新型RVB与患病驹腹泻病的关联。
**2. MO-ERVB-25的全基因组测序与遗传特征。** 除末端非编码区的部分序列外，获得全部11个节段序列。BLASTn显示其与KY-ERVB-21各节段仅有69.29%–76.60%核苷酸同源性；在VP1、VP2、VP4、VP6与VP7节段上，MO-ERVB-25与牛RVB毒株相似性最高（71.25%–73.81%），唯VP3节段与KY-ERVB-21更近（70.43%）；非结构基因与猪或山羊RVB毒株相似性最高，但查询覆盖度变异较大（25%–99%）。BLASTp显示其氨基酸同源性为43.32%–80.00%，其中VP6与NSP2较保守（分别为78.52%与80.00%），而NSP1、NSP3、NSP4与NSP5/6高度分化（低于55%）；与KY-ERVB-21结构蛋白的氨基酸同源性为66.67%–79.28%。核苷酸与氨基酸层面最高相似性宿主的不一致，可能反映核苷酸层面的进化约束，亦可能提示两株ERVB的趋同进化与不同进化谱系来源。VP4分析中，核苷酸层面与牛RVB最相似而氨基酸层面与KY-ERVB-21同源性更高，提示功能约束及对马宿主的后续适应。总体而言，该毒株与牛、猪、山羊及马RVB存在不同程度的相似性，反映宿主适应谱系的长期独立进化与深层进化关系，而非近期重配事件。
**3. 采用靶向VP7基因的RT-qPCR在馬与牛粪便样本中检测MO-ERVB-25。** 由于针对KY-ERVB-21及类似毒株的诊断RT-qPCR无法检出MO-ERVB-25，研究人员建立了靶向VP7与VP6的RT-qPCR方法，并以特异性更优的VP7法确认阳性。原始粪便样本VP7扩增Ct值为12.56，病毒载量高达5.4 × 10
9 RNA拷贝/mL；两种方法对KY-ERVB-21及类似毒株、牛RVB与ERVA均为阴性，支持其特异性。筛查187份南达科他州牛粪便样本，无一阳性；而140份腹泻驹样本中6份（4.2%）VP7 RT-qPCR阳性，且均伴临床腹泻，并在常规检测组合中为阴性。部分阳性驹样本对其他肠道细菌呈一定水平扩增（驹2产气荚膜梭菌Ct 36.9；驹4艰难梭菌Ct 36.14、胞内劳森菌Ct 28.23），而驹1、3、5无其他肠道病原证据。结果提示MO-ERVB-25已在美国驹群中出现并传播，且与既往病原未明的驹腹泻病例相关。
**4. MO-ERVB-25的系统发育分析与基因型分类。** 基于所有RV种代表毒株的VP6系统发育分析显示，MO-ERVB-25聚集于RVB群内并与其他RV种明显分开；在RVB群内则形成具强bootstrap支持的独立分支，支持其为新的RVB VP6基因型（I[X]）。VP4节段未聚集于任何已定义P基因型，而是形成接近马—反刍动物混合簇（P[3]基因型）的独立谱系，并与猪谱系（P[4]至P[8]）明显区分，提示宿主物种的选择压力促进了VP4进化，使VP8*与VP5*适应马宿主；VP7节段属于与所有已知G基因型分离的新分支，被归为新的G基因型（G[X]）；VP1、VP2与VP3同样未聚集于任何既定基因型（R[X]、C[X]、M[X]）。非结构基因中，NSP1形成独特分支（A[X]），其树型与VP7相似，完全位于已知RVB毒株之外；NSP2形成高bootstrap支持的少见分支，与猪N[5]、N[6]基因型较近而与多数N[8]至N[10]猪毒株明显分开；NSP3、NSP4与NSP5亦形成既定基因型簇之外的独立分支（T[X]、N[X]、E[X]、H[X]）。上述结果表明MO-ERVB-25在几乎所有节段上均从猪、山羊、牛及KY-ERVB-21等毒株中分支而出且保持遗传独特性，支持其为高度分化的RVB毒株。
**5. MO-ERVB-25 VP4与VP7节段的进化速率与tMRCA分析。** 分子钟与贝叶斯分析估计，MO-ERVB-25 VP4与VP7的核苷酸替换率分别为1.44 × 10
?3与9.97 × 10
?4替换/位点/年，VP4显著高于VP7，提示VP4承受更强的选择压力，与其介导吸附（VP8*）与穿入（VP5*）的功能相符。KY-ERVB-21各序列间的tMRCA估计为VP4约2019年（95% HPD：2015–2021）、VP7约2020年（95% HPD：2018–2021），即发现前约1–2年；KY-ERVB-21与MO-ERVB-25的分化时间估计为VP4约744年（95% HPD：?736至1,812）、VP7约355年（95% HPD：?1,125至1,336）。尽管MO-ERVB-25直至2025年才被发现，其在进化史上与KY-ERVB-21的分化可能已超过1,000年；有限的RVB序列（尤其马源序列）给时间估计带来不确定性。结果支持MO-ERVB-25的镶嵌基因组结构，可能源于长期独立进化与重配驱动的多样化。
**6. 基于结构的VP8*比较分析显示保守结构伴表面暴露的分化。** 由于RVB VP8*序列同源性低，常规多序列比对被认为不可靠，研究人员采用基于结构的比对：AlphaFold预测的MO-ERVB-25与KY-ERVB-21 VP8*叠加于人类RVB VP8*实验结构（PDB ID: 7SRW）。尽管氨基酸同源性低，MO-ERVB-25 VP8*仍保留人类RVB VP8*的β折叠骨架（包括β1–β7链），提示结构核心支架受强进化约束；分化见于连接β链的环区，如73–76位残基（SEGE）形成连接β3与β4链的高度暴露环，与KY-ERVB相应区域（TDNG）构象不同。值得注意的是，KY-ERVB-21 VP8*预测模型显示存在独特的α2螺旋，而MO-ERVB-25 VP8*及人类RVB VP8*晶体结构（并经AlphaFold预测确认）均缺乏该C端α2螺旋；该螺旋位于表面暴露区域，可能参与毒株特异性结构稳定、独特宿主聚糖结合或抗原景观重塑。RelSASA计算显示，MO-ERVB-25 VP8*埋藏残基比例更高（33.1% vs 25.7%），高度暴露残基比例较低（32.2% vs 39.6%），提示其结构排布更紧凑。线性表位预测显示其多位于序列保守区，但KY-ERVB-21与MO-ERVB-25之间的推定线性表位氨基酸序列差异显著；不连续表位分析显示两毒株间既有共同区域亦有各自独特区域。
**7. MO-ERVB-25与KY-ERVB-21 VP8*结构域识别完全不同的聚糖。** 研究人员制备并纯化MO-ERVB-25、KY-ERVB-21与Goat-ERVB-21的GST-VP8*融合蛋白进行糖芯片实验（KY-ERVB-21与Goat-ERVB-21 VP8*同源性约99%）。结果显示，KY-ERVB-21与Goat-ERVB-21均识别含α?2,8-连接polySia的聚糖作为感染附着因子，其结合最强的3种聚糖中2种（ID#221与#225）含α-2,8-连接Neu5Ac基序，另含ID#214；α-2,8-连接polySia已被确立为肠道人类腺病毒52型的入侵受体。相反，MO-ERVB-25不结合这些含α-2,8-连接Neu5Ac的聚糖，而识别含N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）的聚糖：结合最强的3种中，ID#508与#498含重复Galβ1-4GlcNAc单元（即LacNAc），分别属复杂与延伸复杂N-连接聚糖，ID#63含简单Galβ1-4Glc构筑基序。结合完全不同类别聚糖进一步支持两株ERVB的进化与功能分化；人类RVB VP8*亦结合含LacNAc的聚糖，与MO-ERVB-25相似，提示二者缺乏C端α2螺旋可能驱动了与KY-ERVB-21的聚糖结合差异。
**五、讨论与结论**
讨论指出，ERVB自2021年肯塔基州暴发以来已成为驹腹泻的重要病原，循环毒株可能源于山羊等反刍动物储库；现有疫苗仅防ERVA，母源ERVA特异性抗体不能保护驹免受ERVB感染，而将分子诊断纳入常规检测显著提升了对ERVB流行、传播动态及遗传与抗原多样性的认识。本研究报道的MO-ERVB-25未被包含KY-ERVB-21的常规检测组合检出，凸显靶向诊断对遗传分化或未知轮状病毒的局限；宏基因组测序与形态学证据共同确证感染。新建立的RT-qPCR在140份特发性驹腹泻样本中检出4.2%阳性（样本来自2025年产驹季的肯塔基州），提示该毒株至少在密苏里与肯塔基两州存在并传播，但因样本量有限，其真实流行率与分布仍不清楚。全基因组与系统发育分析显示，MO-ERVB-25在全部11个节段上的核苷酸同源性处于或低于RVB基因型阈值下限，结构基因与牛毒株最近、非结构基因与猪或山羊毒株较近，NSP1、NSP3、NSP4与NSP5同源性极低；核苷酸与氨基酸层面关系的不一致提示RVB基因组承受差异化进化约束，即在广泛核苷酸分化的同时维持蛋白功能保守以利于宿主适应、生存与复制；VP4的核苷酸与蛋白序列均与KY-ERVB-21较相似，支持VP4蛋白层面的宿主特异性适应，也解释了该毒株仅在驹样本中检出而未在牛中检出的现象。贝叶斯分子钟分析支持其相对既往马源与反刍动物RVB的进化分化，VP4较高的替换率反映其承受更强的宿主互作与入侵相关选择压力。基于Shepherd等提出的阈值（VP1 78%、VP2 79%、VP3 77%、VP4 80%、VP6 81%、VP7 80%、NSP1 76%、NSP2 83%、NSP3 78%、NSP4 76%、NSP5 79%），KY-ERVB-21类毒株属G3P3基因型，而MO-ERVB-25各节段均形成独立分支，被暂定为R[X]-C[X]-P[X]-G[X]-N[X]-T[X]-E[X]-H[X]等新基因型，反映其遗传独特性。讨论还提出逐步重配机制：KY-ERVB-21可能源自反刍动物并经多次重配事件后溢出至马，随后经选择与有利基因组组合积累实现持续循环；而MO-ERVB-25与KY-ERVB-21高度分化，受RVB序列数据库有限之限难以追溯其祖先，数据亦未证明其已形成如KY-ERVB-21般的广泛流行，但可能代表宿主适应的早期阶段。结构建模、糖芯片与进化研究显示：MO-ERVB-25 VP8*与人类RVB一样缺乏KY-ERVB-21 VP8*中存在的C端α2螺旋，该表面暴露螺旋可能参与结合独特宿主聚糖；MO-ERVB-25偏好化学中性含LacNAc的复杂N-连接聚糖，KY-ERVB-21偏好带负电荷的α-2,8-连接polySia；VP8*在保持保守结构支架的同时发生表面暴露区的构象重塑，产生毒株特异性抗原景观与差异表面可及性，可能限制毒株间交叉反应抗体识别，上述预测仍需实验证实。
研究结论（翻译）：总体而言，研究结果表明MO-ERVB-25代表一个既往未被表征的新型RVB毒株，凸显了在马属动物中循环的RVB毒株的进化复杂性。此外，MO-ERVB-25的核苷酸同源性低于既定的RVB基因型阈值（76%–83%），支持其属于新的基因型星座。上述发现强调需要对循环ERVB进行持续监测、改进分子诊断方法，并建立稳健的马源RVB分类体系，以更好地理解RVB进化、传播及其在马中的疾病负担的复杂性。
