SARS-CoV-2膜（M）蛋白通过激活TLR4诱导炎症反应

《mSphere》：SARS-CoV-2 membrane (M) protein activates TLR4 to induce an inflammatory response

　　

严重COVID-19的主要致病原因是过度炎症反应，即"细胞因子风暴"。病毒RNA及其结构蛋白是SARS-CoV-2诱导炎症的关键介质。尽管SARS-CoV-2 RNA及结构蛋白刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）所诱导的免疫传感器与宿主炎症反应已被充分阐明，但膜蛋白（M）在炎症/抗病毒反应中的作用以及介导M蛋白免疫反应的信号通路尚未得到充分表征。本研究表明，SARS-CoV-2 M蛋白可在小鼠和人类巨噬细胞及肺组织中诱导强烈的炎症细胞因子反应。研究还表明，M蛋白诱导的炎症反应依赖于Toll样受体4（TLR4）信号传导，且髓样分化因子88（MyD88）是驱动炎症的关键接头蛋白，而TIR结构域含接头蛋白诱导干扰素β（TRIF）主要参与抗病毒干扰素（IFN）反应。对下游信号通路的详细评估突出了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）分子JNK和细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的关键作用，其次是核因子κB（NF-κB）和p38信号在M蛋白-TLR4介导的炎症反应中的作用。最后，本研究表明，阻断M蛋白诱导的ERK1/2和p38信号可降低野生型巨噬细胞中炎症细胞因子的产生并恢复I型干扰素的产生，而抑制JNK和NF-κB则抑制M蛋白诱导的炎症和抗病毒细胞因子反应。总之，上述结果证明SARS-CoV-2 M蛋白通过TLR4-MyD88/TRIF激活诱导促炎细胞因子和I型干扰素，其中MAPK激活发挥主导作用，并为特异性靶向MAPK信号以减轻SARS-CoV-2诱导的过度炎症和病理损伤提供了依据。

**研究背景与问题的提出**

致病性人冠状病毒（hCoVs）对公共卫生构成重大威胁。SARS-CoV与MERS-CoV各自引起相对局限的暴发（确诊病例均<10,000例），病死率分别约为10%和36%；而SARS-CoV-2则引发全球COVID-19大流行，累计病例超过7.75亿、死亡逾700万例。重症SARS-CoV-2感染以高热、持续咳嗽和明显呼吸困难为特征，易感个体常进展为急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。病毒感染过程中免疫失调导致炎症细胞因子/趋化因子过度产生即"细胞因子风暴"，被认为是重症与死亡的原因；糖皮质激素和IL-6拮抗剂等免疫调节治疗可改善住院患者预后，进一步提示炎性细胞因子是致病与致死的关键驱动因素。

SARS-CoV-2病毒粒子由结构蛋白、非结构蛋白和辅助蛋白组成。在四种结构蛋白中，刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）可激活细胞表面Toll样受体（TLRs），增加促炎介质产生，主要经由核因子κB（NF-κB）和/或丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。M蛋白是丰度最高的结构蛋白，对病毒粒子组装和感染性至关重要，但其先天免疫信号通路研究不足，在SARS-CoV-2诱导炎症中的作用尚未确定。既往关于SARS-CoV-2结构蛋白、辅助蛋白及病毒单链/双链RNA激活MAPK与NF-κB信号的研究，对M蛋白的贡献刻画不充分。忽视M蛋白在感染诱导炎症中的作用，构成理解SARS-CoV-2免疫失调与致死性炎症的重要缺口。因此，本研究旨在表征SARS-CoV-2 M蛋白诱导的炎症反应，并确立不同表面受体、接头蛋白及下游MAPK、NF-κB信号通路的作用。

**主要技术方法**

研究人员以野生型（WT）及免疫传感器/接头蛋白基因敲除（TLR2^?/?、TLR4^?/?、MyD88^?/?、TRIF^?/?）C57BL/6J小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）为核心模型，比较两种商品化重组M蛋白（Kerafast来源1全长蛋白、eENZYME来源2截短蛋白），并依据厂家提供的鲎试剂（LAL）检测结果设置内毒素对照（LPS-C），辅以多黏菌素B中和实验排除残余内毒素干扰。细胞与分子层面采用ELISA、32重多因子检测、流式细胞术胞内染色、Western blot及通路特异性抑制剂（BAY 11-7082、trametinib、losmapimod、JNKiii）干预。体内实验对雌性C57BL/6J小鼠经鼻给予M蛋白（10 μg/只），检测肺组织RT-qPCR及盲法组织病理学评分。人源样本采用ATCC来源人外周血单个核细胞（hPBMCs）经M-CSF分化为单核/巨噬细胞，并以TLR4抑制剂resatorvid处理。

**研究结果**

*SARS-CoV-2 M蛋白是炎症细胞因子和趋化因子的强效诱导剂。* 经考马斯染色和Western blot确认两种来源M蛋白分子量分别约为25 kDa（全长）和15 kDa（截短），符合预期；ELISA显示M蛋白刺激的小鼠BMDMs上清TNF-α水平较LPS-C及未刺激对照显著升高，多黏菌素B处理不影响TNF-α产生；人PBMC来源单核细胞及流式胞内染色亦证实TNF-α显著升高，表明M蛋白在鼠和人巨噬细胞中均诱导强烈促炎细胞因子产生。

*SARS-CoV-2 M蛋白在小鼠肺内诱导强烈炎症细胞因子反应。* 小鼠经鼻给予M蛋白后，肺组织多种炎症细胞因子和趋化因子mRNA水平在处理后12 h显著升高，而4 d时升高不明显；I型抗病毒干扰素（IFN-α、IFN-β）转录水平在处理后12 h与4 d均极低，提示M蛋白在肺内诱导炎症介质而不诱导抗病毒细胞因子。

*SARS-CoV-2 M蛋白在小鼠中诱导炎症与肺病理损伤。* 组织学评估显示M蛋白处理肺组织出现显著的支气管周围及血管周围免疫细胞浸润、支气管间质性肺炎、水肿/纤维蛋白沉积及总体炎症升高，累积病理评分更高；且0.5 d与4 d两时间点炎症与病理评分均显著高于PBS对照，两时间点间无显著差异，提示尽管晚期炎性细胞因子/趋化因子水平下降，肺部炎症与病理改变持续存在。

*SARS-CoV-2 M蛋白激活TLR4诱导炎症细胞因子反应。* 与WT相比，TLR4^?/? BMDMs的炎症细胞因子、趋化因子及IFN-β水平显著降低，而TLR2^?/?细胞仅IL-6和IFN-β轻度下降、TNF-α无变化；人单核/巨噬细胞经TLR4抑制剂处理后TNF-α与IFN-β显著降低。接头蛋白层面，MyD88^?/?细胞炎症细胞因子和趋化因子持续显著降低；TRIF^?/?细胞对部分因子（IFN-β、IL-10、MIP-1α）降低、部分（TNF-α、IL-6）不变、部分（G-CSF、MIP-2）升高；来源2 M蛋白经流式胞内染色亦显示TLR4^?/?、MyD88^?/?及程度较轻的TRIF^?/?细胞TNF-α显著减少。表明TLR4-MyD88信号对M蛋白诱导的炎症与抗病毒细胞因子反应至关重要。

*M蛋白诱导的炎症细胞因子产生同时需要MAPK和NF-κB通路。* Western blot显示TLR4^?/?细胞中磷酸化ERK1/2、p38、JNK及p65活化均降低，以p-ERK1/2和p-JNK降幅最大；TLR2^?/?细胞除p-JNK外几乎不参与；MyD88^?/?细胞四条通路活化均降低且以p-JNK降幅最大，且M蛋白介导的活化较LPS更依赖MyD88，提示二者下游通路不同；TRIF^?/?细胞p-ERK与p-JNK降低而p-p38、p-p65不变。

*MAPK与NF-κB信号在M蛋白诱导的细胞因子反应中作用不同。* 通路抑制剂验证有效后，NF-κB抑制使TNF-α、IL-6、MCP-1和IFN-β完全或近乎完全降低；ERK1/2抑制显著降低MCP-1与TNF-α而显著升高IFN-β；p38抑制不降低炎症细胞因子但显著恢复IFN-β；JNK抑制除MCP-1轻度下降外无影响。表明抑制特定MAPK/NF-κB通路可减少促炎细胞因子并恢复I型IFN抗病毒反应，尤以ERK1/2通路为著。

**讨论与结论**

讨论指出，冠状病毒病毒粒子的结构蛋白与单链RNA基因组可经模式识别受体激活诱导强烈细胞因子/趋化因子反应；SARS-CoV-2 ssRNA基因组、dsRNA中间体及S、N、E蛋白诱导抗病毒与炎症反应已明确，而丰度最高的M蛋白在宿主免疫中的作用描述不足。SARS-CoV与MERS-CoV M蛋白已知可诱导NF-κB活性并抑制I型IFN反应，但诱导MAPK与NF-κB活化的关键通路未明。既往M蛋白研究主要集中于NLRP12炎症小体激活及直接抑制RIG-I/MDA-5-MAVS-TBK1信号（致TBK1降解），其诱导NF-κB活化与细胞因子产生的机制未获探讨。本研究显示M蛋白与其它结构蛋白相似，以TLR4为表面受体并利用MyD88与TRIF双接头，这种双通路利用可能促成其强促炎活性；M蛋白对TLR2的有限利用可能与单核/巨噬细胞高表达TLR2有关。研究通过LPS-C对照、多黏菌素B中和及下游信号差异排除了残余内毒素的影响。在信号层面，S、E、N蛋白的促炎细胞因子产生主要经NF-κB与ERK1/2，而M蛋白独特地利用ERK1/2、p38和p65并强烈激活JNK；尽管TLR4^?/?与MyD88^?/?细胞JNK活性显著下降，单独阻断JNK并不降低炎症细胞因子，提示JNK作用较小，联合抑制NF-κB与ERK/p38 MAPK可能更有效缓解M蛋白诱导的强烈炎症。体内结果显示早期与晚期均存在显著病理改变，基因表达在0.5 dpt显著升高而4 dpt不升高，提示M蛋白诱导快速而短暂的细胞因子/趋化因子反应，而肺病理改变持续更久，可能与结构蛋白在组织中长期稳定存在有关。M蛋白单独不足以产生干扰素反应，阻断p38与ERK1/2可恢复IFN-β水平，提供了减炎并促进抗病毒反应的可靶向策略。总之，研究证明丰度最高的结构蛋白M蛋白是促炎细胞因子、趋化因子及肺部病理改变的关键诱导者，其受体使用具细胞因子特异性但优先经TLR4-MyD88信号，MAPK与NF-κB通路（尤其ERK1/2-MAPK）被激活以促进大量促炎细胞因子产生；抑制MAPK与NF-κB亚通路（尤其ERK1/2）可抑制促炎信号，而抑制ERK1/2与p38可恢复干扰素反应，提示该策略可在活动性SARS-CoV-2感染中减轻免疫失调并改善宿主抗病毒反应。