《mSystems》：Gut microbiome and metabolomics reveal the role of thioproline in attenuating colorectal cancer-associated inflammation
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结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球发病率和死亡率均居前三位的恶性肿瘤，其发生发展可能受肠道炎症环境影响，而肠道炎症常与肠道菌群失调（gut microbiota dysbiosis）相关。食物生物活性物质（food bioactiv
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球发病率和死亡率均居前三位的恶性肿瘤，其发生发展可能受肠道炎症环境影响，而肠道炎症常与肠道菌群失调（gut microbiota dysbiosis）相关。食物生物活性物质（food bioactives）可通过抗炎及表观遗传机制调节肠道菌群。鉴于噻脯氨酸（thioproline）作为具有抗氧化特性的食物生物活性物质的重要作用，其调节肠道菌群并缓解CRC的潜力仍很大程度上未被探索。本研究旨在了解噻脯氨酸对肠道菌群群落的影响，并探究噻脯氨酸调节肠道菌群及发挥抗癌作用的机制。研究人员采集了健康小鼠、CRC小鼠及噻脯氨酸治疗CRC小鼠的粪便和肠道组织样本。宏基因组（metagenome）和代谢组（metabolome）数据显示，噻脯氨酸治疗显著改变了CRC小鼠的肠道菌群群落组成和代谢。这些CRC相关的肠道菌群和细菌代谢物恢复至正常水平。此外，在噻脯氨酸治疗下，CRC小鼠的微生物-代谢物相互作用（microbial-metabolite interactions）转向更接近健康小鼠所观察到的模式。噻脯氨酸治疗提高了小鼠体内亚油酸（linoleic acid）水平，表明其具有促进亚油酸代谢以治疗性恢复稳态并缓解CRC炎症的作用。苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, HE）染色进一步证实噻脯氨酸缓解了CRC小鼠的炎症。本研究凸显了噻脯氨酸在调节肠道菌群群落和细菌代谢、调控细菌-宿主相互作用（bacteria-host interactions）以及最终减轻CRC炎症方面的双重作用。这些发现为未来研究和治疗应用提供了有价值的见解。重要性：结直肠癌（CRC）与肠道菌群失调和肠道炎症相关。虽然食物生物活性物质可调节微生物组，但噻脯氨酸是否通过微生物调节发挥对CRC的抑制作用仍未知。研究人员采用整合宏基因组学和代谢组学，表明噻脯氨酸治疗可将被CRC破坏的肠道菌群组成和细菌代谢物恢复至接近正常水平。重要的是，噻脯氨酸重塑了微生物代谢物相互作用网络、提高了亚油酸水平并缓解了肠道炎症。本研究提供了关于单一膳食生物活性化合物如何重塑肠道微生物生态系统及其代谢景观以减少CRC炎症的系统层面视角。研究人员的发现提示，以微生物组为靶点的营养策略可能通过调节肠道菌群和肠道微环境在防止CRC进展中发挥作用。
一、研究背景
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）在全球所有癌症中发病率居第三位、死亡率居第二位，已成为重大全球健康负担。肠道菌群（gut microbiota）作为由数万亿微生物组成的复杂生态系统，被视为深刻影响人体生理、代谢与免疫功能的“隐藏器官”。近几十年大量研究已确立肠道菌群是多种胃肠道疾病的关键致病因素。新近证据显示，微生物群落积极参与CRC的整个致癌级联过程，包括肿瘤起始、进展和远处转移。肠道菌群失调（gut microbiota dysbiosis）损害肠黏膜屏障，触发局部肠道炎症及全身低度炎症，进而加重微生物失衡，这一慢性肠道炎症的恶性循环最终驱动结直肠癌发生。新近研究表明，肠道菌群对CRC的影响部分源于宿主和/或微生物组代谢或共代谢，因此重塑肠道菌群可能成为CRC治疗的重要靶点。
既往研究表明，膳食生物活性化合物（dietary bioactive compounds）可通过调节肠道菌群组成、减轻肠道炎症和调控宿主代谢来缓解CRC。然而，尽管以微生物群为靶点的营养干预日益受到关注，噻脯氨酸（thioproline）对CRC的作用仍很大程度上未知；特别是噻脯氨酸是否通过同时调节肠道微生物群落和微生物群相关代谢发挥保护作用，尚未被系统研究。肠道菌群具有高度可塑性，可动态响应各种外源和内源刺激，而饮食是塑造其分类组成和功能潜力的有前景因素，为微生物群靶向调控提供了可行途径。噻脯氨酸是一种富含于发酵食品（如韩国大酱、红葡萄酒和酱油）中的氨基酸类似物，具有双重功能：作为自由基清除剂对抗心血管疾病等炎症状态，以及作为微生物调节剂在厌氧环境中对大肠杆菌（Escherichia coli）显示选择性活性。基于这些发现及研究人员既往将CRC与菌群失调和炎症相联系的工作，研究人员假设具有抗氧化特性、广泛存在于发酵食品中的氧化应激生物标志物噻脯氨酸，可能通过调节肠道微生物群落对CRC进展发挥潜在保护作用。为此，本研究旨在确定噻脯氨酸能否通过调节肠道菌群及微生物群相关代谢抑制CRC进展；研究人员采用16S rRNA测序和靶向代谢组学（targeted metabolomics）获得宏基因组和代谢组数据，通过整合这些多组学数据集系统评估噻脯氨酸的抗CRC作用并阐明其潜在机制；同时对肠道组织进行苏木精-伊红（HE）染色，显示噻脯氨酸有效缓解了CRC小鼠的炎症。
二、主要关键技术方法
研究采用15只4周龄C57BL/6小鼠（购自南京医科大学），均分健康组（H）、CRC组（C）和噻脯氨酸治疗CRC组（T），每组5只。CRC与T组经腹腔注射氧化偶氮甲烷（AOM，12.5 mg/kg），随后循环给予2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）饮水（1周给药、2周停药，连续三个3周周期）；第10周起T组给予噻脯氨酸（50 mg/kg）2周。关键技术包括：粪便DNA提取与16S rRNA基因V3–V4区高通量测序（QIIME2/deblur获得扩增子序列变体ASV，计算α、β多样性及PCoA、PERMANOVA分析，LEfSe、limma差异分析，PICRUSt2功能预测）；基于LC-MS/MS的靶向代谢组学（HM350化合物库，PCA及KEGG通路富集）；Mfuzz时序聚类分析；以及MMvec整合微生物组与代谢组数据构建微生物-代谢物相互作用网络；并以HE染色评估肠道炎症。
三、研究结果
（一）噻脯氨酸调节肠道菌群多样性并恢复菌群组成。15个样本共获249,467条高质量16S rRNA序列，鉴定1,092个ASV。与H组相比，CRC组Chao1和ACE指数显著下降，而T组较CRC组大幅升高，提示噻脯氨酸有效抵消了CRC诱导的多样性下降。基于Bray-Curtis和加权UniFrac距离的PCoA显示组内聚集、组间分离明显，CRC与H组显著分离，T组居中间位置，表明噻脯氨酸治疗减弱了CRC与健康小鼠间的微生物群落差异。
（二）噻脯氨酸缓解CRC小鼠肠道菌群失调。门水平上，三组均以拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）为主；CRC组放线菌门（Actinobacteriota）和疣微菌门（Verrucomicrobiota）相对丰度高于H和T组；CRC组拟杆菌门丰度显著低于H组，T组则回升；CRC组厚壁菌门显著升高，噻脯氨酸治疗后降低；CRC组厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比值显著升高，治疗后被显著降低。科水平上，CRC小鼠鼠杆菌科（Muribaculaceae）和乳杆菌科（Lactobacillaceae）显著减少，拟杆菌科（Bacteroidaceae）显著增加，这些变化经噻脯氨酸治疗可被逆转。属水平上，CRC与H组间有19个属存在显著差异，CRC组Muribaculum、[Eubacterium]_xylanophilum_group、Enterorhabdus和Roseburia显著减少，而Bacteroides、Lachnospiraceae_UCG-006、Pseudomonas和Acinetobacter显著富集；CRC与T组间亦有19个属显著不同；T与H组间15个属存在显著差异，提示噻脯氨酸可能未能将菌群完全恢复至原始状态。LEfSe分析鉴定出9个细菌类群为CRC发展的关键贡献者，噻脯氨酸治疗使Eubacterium_xylanophilum_group、Muribaculum、Roseburia、Pseudomonadaceae和Pseudomonas的异常水平趋于正常。PICRUSt2分析显示CRC与H组间有18条代谢通路显著改变，T组呈现与CRC组不同的功能谱，其中16条通路与H-CRC差异通路重叠且方向一致，提示噻脯氨酸部分恢复微生物正常功能。
（三）噻脯氨酸通过调节肠道菌群代谢对抗CRC。靶向代谢组学共鉴定并定量274种代谢物，PCA显示三组代谢谱明显不同且QC样本紧密聚集，T组代谢谱呈中间聚类模式。CRC与H组间47种代谢物差异丰度（23种上调、24种下调）；T与CRC组间72种差异代谢物（50种上调、22种下调）。KEGG分析显示CRC组氨基酸和脂质代谢通路显著紊乱，46条富集通路中7条具统计学显著性（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，色氨酸代谢，嘧啶代谢，丙酸代谢，烟酸和烟酰胺代谢，脂肪酸生物合成及β-丙氨酸代谢）。T与CRC组差异代谢物富集于57条通路（23条显著富集），主要涉及碳水化合物代谢、碳代谢、蛋白质氨基酸相关代谢及嘌呤代谢和胆汁酸代谢。17种代谢物在两组比较中持续失调，其中12种经噻脯氨酸治疗显著逆转。
（四）噻脯氨酸改变CRC小鼠微生物与代谢物的相互作用。MMvec整合分析在H、CRC和T组分别鉴定149、208和270个高置信度微生物-代谢物相互作用。CRC组中Muribaculaceae、Enterorhabdus和Bacteroides与关键代谢物的相关性较健康组显著改变：Muribaculaceae在H组主要呈负相关，CRC组转为以正相关为主；Enterorhabdus由混合相关转为以正相关为主；Bacteroides在H组呈负相关而CRC组呈正相关，如与L-谷氨酰胺在H组负相关、CRC组显著正相关。CRC中与Bacteroides显著互作的代谢物富集于癌症中心碳代谢、戊糖与葡萄糖醛酸相互转化、蛋白质消化吸收及精氨酸和脯氨酸代谢等通路，提示Bacteroides可能是CRC发病的潜在关键介导者。CRC组中Bacteroides与20种代谢物正互作，而T组仅与3种互作，提示噻脯氨酸可影响Bacteroides与代谢物的互作。T组中Muribaculum、[Eubacterium]_xylanophilum_group和Roseburia等属与多种代谢物显著相关；Roseburia在CRC组与代谢物相关性缺失，而在H和T组存在，提示噻脯氨酸可能促进Roseburia与特定代谢物的互作以发挥抗癌特性。
（五）代谢变化的时序分析。Mfuzz分析将数据聚合为24个簇，其中6个簇符合预期变化模式。54种代谢物在噻脯氨酸治疗后恢复至接近健康水平：簇4、10、19中的18种代谢物因CRC发展显著升高而在治疗后回落（图6A–C）；簇5、11、17中的36种代谢物在CRC发生后下降而在治疗后回升（图6D–F）。KEGG富集显示这54种代谢物显著富集于9条通路，包括不饱和脂肪酸生物合成、色氨酸代谢、脂肪酸生物合成及戊糖与葡萄糖醛酸相互转化。上述结果提示噻脯氨酸可能通过影响癌细胞能量摄取和生物膜合成抑制CRC进展。
（六）噻脯氨酸缓解肠道炎症。基于HE染色组织切片按严重程度评分（1轻微、2轻度、3中度、4重度，无病变记0分），CRC组炎症水平显著高于H组，而噻脯氨酸治疗缓解了CRC小鼠炎症，使健康与CRC小鼠间炎症水平不再呈现显著差异。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究中H、CRC和T组肠道菌群组成显著不同，门水平上CRC进展伴随拟杆菌门下降和厚壁菌门升高，噻脯氨酸治疗逆转了这些变化；鉴于F/B比值的背景依赖性，研究将其与整体群落结构联合解释。噻脯氨酸亦逆转了科、属水平上CRC相关改变，Muribaculaceae、Lactobacillaceae和Bacteroidaceae恢复至接近健康水平。比较H-CRC与T-CRC共享的16条显著差异代谢通路，CRC相关功能差异在噻脯氨酸治疗后大幅减少，提示噻脯氨酸可能通过影响肠道菌群功能对抗CRC。CRC小鼠47种显著改变代谢物富集于缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、色氨酸代谢、嘧啶代谢、丙酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、脂肪酸生物合成及β-丙氨酸代谢等通路；噻脯氨酸治疗小鼠72种显著改变代谢物富集于ABC转运蛋白（ABC transporters）、D-氨基酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢及癌症中心碳代谢等通路。时序分析显示54种代谢物响应噻脯氨酸治疗恢复至接近健康水平，主要参与不饱和脂肪酸生物合成、色氨酸代谢、脂肪酸生物合成及戊糖与葡萄糖醛酸相互转化四条通路；其中10Z-heptadecenoic acid、亚油酸和N-乙酰血清素（N-acetylserotonin）在CRC发展或噻脯氨酸治疗中显著改变，10Z-heptadecenoic acid和N-乙酰血清素具抗氧化特性，噻脯氨酸增强了抗氧化还原力以对抗CRC氧化应激；亚油酸是决定炎症程度的靶代谢物，噻脯氨酸促进肠道菌群中亚油酸代谢，治疗性恢复CRC小鼠亚油酸水平。微生物-代谢物互作方面，Bacteroides参与CRC发展，CRC小鼠中其与多种代谢物显著正相关，健康小鼠中多为负相关，噻脯氨酸治疗后这种正相关完全消失；Muribaculaceae和Enterorhabdus的相关性在噻脯氨酸处理后亦被改变；T组中出现的与健康小鼠方向一致的微生物-代谢物相关性在CRC组中缺失，表明噻脯氨酸可改变微生物与代谢物互作以对抗CRC。作者亦承认样本量相对有限可能降低统计效能并影响微生物组和代谢组分析的稳健性与可重复性，但多组学层面的一致性支持其主要结论，并认为这些结果值得在独立、更大的队列中验证。
结论：本研究凸显了噻脯氨酸通过改变粪便微生物组组成防御CRC的重要作用。粪便微生物组与代谢组的整合分析显示，与CRC相关的肠道菌群和代谢物在CRC小鼠中发生显著变化，而噻脯氨酸治疗后这些CRC相关菌群和代谢物恢复至正常水平。噻脯氨酸可能通过调节Muribaculaceae、Lactobacillaceae和Bacteroidaceae的丰度对CRC进展发挥保护作用。同时，整合与统计分析显示噻脯氨酸显著改变包括10Z-heptadecenoic acid、亚油酸和N-乙酰血清素在内的多种代谢物水平，提示调节这些代谢物可能有助于噻脯氨酸对CRC进展的潜在保护作用，这些代谢物参与不饱和脂肪酸生物合成、色氨酸代谢、脂肪酸生物合成及戊糖与葡萄糖醛酸相互转化等代谢通路。此外，噻脯氨酸治疗的CRC小鼠中微生物与代谢物之间的互作变得更接近健康小鼠。这些发现强调了噻脯氨酸在塑造粪便微生物组以防御CRC方面的潜在价值，为未来研究和应用提供了有价值的见解。
