《Nucleic Acids Research》：mobileRNA: an integrative, automated tool for accurate identification of mobile RNA molecules based on multiple genome mapping
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RNA分子可作为细胞间信号，已有证据表明信使RNA（mRNA）和小RNA（sRNA）均能进行长距离运输。这类从其起源细胞移动至其他部位的分子被称为移动RNA（mobile RNA）。在嫁接植物中，当不同基因型被接合在一起时，利用所涉基因组间天然多态性的方法可揭
RNA分子可作为细胞间信号，已有证据表明信使RNA（mRNA）和小RNA（sRNA）均能进行长距离运输。这类从其起源细胞移动至其他部位的分子被称为移动RNA（mobile RNA）。在嫁接植物中，当不同基因型被接合在一起时，利用所涉基因组间天然多态性的方法可揭示RNA在组织间的移动。然而，现有方法受高水平技术噪声困扰，且缺乏标准化流程，使研究人员难以稳健地鉴定移动RNA分子。在此，研究人员提出一款自动化流程mobileRNA，其采用多基因组策略，基于将RNA测序数据同时比对至合并的参考基因组。研究人员利用模拟嫁接组合对该方法进行验证，并与其他方法进行比较。当将mobileRNA应用于真实数据时，研究人员发现其与现有移动mRNA注释重叠度很低，这与近期质疑既往报道移动mRNA可靠性的研究相一致。研究人员引入基因组可映射性指数（genome mappability index）作为判断移动RNA检测可能成功与否的标准，发现基于单核苷酸多态性（SNP）或两步映射的策略由于错误及可映射性差而存在固有局限，相比之下，具有较大进化距离的跨物种嫁接更具优势。
**研究背景与问题** 植物嫁接是将两株植物接合成一个整体，待维管连接重建后，新形成的嵌合体继续生长。嫁接在园艺中用于改良经济作物的农艺性状，接穗（scion）贡献地上部，砧木（rootstock）贡献下部茎与根。嫁接亦是研究植物信号传导的重要工具，借助接穗与砧木间维管连通性可研究蛋白质、RNA及激素的运输作用。为研究系统运输的RNA群体即移动RNA，高通量基因组分析与下一代测序（NGS）技术被用于提供定量信息及全基因组变异。针对移动信使RNA（mRNA），RNA测序（RNAseq）是量化转录本表达的首选方法；小RNA测序（sRNAseq）则用于量化具调控作用的非编码小RNA（sRNA），包括微小RNA（microRNA）。若存在参考基因组组装，可将测序读段比对并分析RNA表达水平。当嫁接伙伴为同物种生态型时，可利用单核苷酸多态性（SNP）检测候选移动分子。已有多种流程用于区分RNA分子来源：一类采用独立单参考比对并回收未比对读段，另一类应用下游变异检测与统计以区分噪声与真实多态性。然而两类方法中错误比对读段均可源于映射步骤信息不完整，且迄今均基于单一参考。为此，研究人员提出利用植物异源嫁接标准化长距离RNA移动分析的替代策略，将RNAseq数据集同时比对至两个（或更多）独立参考基因组，使一条RNA读段的所有可能映射位置在单次比对步骤中给出；并以模拟嫁接实验与真实数据集证明该流程可准确将读段映射至其来源基因组，同时指出两参考基因组的相似性极大影响性能。将该方法应用于现有数据集，研究人员证实了采用不同互补方法学的近期发现，即既往报道的移动mRNA群体被高估。为便于重复与使用，研究人员将该方法实现为用于RNAseq与sRNAseq分析的R包，命名为mobileRNA，发布于Bioconductor仓库。
**关键技术方法** 研究人员开发了用于处理与量化嫁接移动RNA表达的分析流程，以清洁的sRNA或mRNA测序读段（FASTQ格式）、基因组组装（FASTA）及对应注释（GFF）为输入；将两个（或更多）参考基因组及其注释合并为单一参考，为每条假分子添加唯一前缀以区分来源；mRNA数据采用HISAT比对并保留唯一映射读段，以HTSeq计数；sRNA数据采用Bowtie比对，ShortStack进行两段式聚类分析与定量；以GenMap计算单核苷酸分辨率可映射性并以BEDtools汇总外显子均值，定义基因组可映射性指数为可映射性高于0.5的外显子区域比例；差异表达采用edgeR或DESeq2并以Benjamini-Hochberg法校正错误发现率（FDR）；采用polyester生成模拟mRNA数据，并以真实公共序列读段数据库（SRA）数据构建混合数据集，涉及茄子与番茄、拟南芥Col-0与Ler-0、Col-0与C24等嫁接组合，另以baymobil进行贝叶斯推断比较。
**研究结果** 其一，基因组可映射性决定嫁接移动RNA鉴定的有效性。研究人员合并茄子与番茄参考基因组模拟种间嫁接，并以拟南芥Col-0与C24或Ler-0组合模拟种内嫁接。使用合并基因组可区分两基因型同源区域并更佳估计映射效率。与各自独立参考相比，所有合并基因组组合的可映射性均下降，茄子/番茄组合平均下降15%，拟南芥各组合约下降40%；茄子/番茄合并基因组中可映射性高于0.5的编码区比例为66%（茄子与番茄单独参考分别为70%与77%）。基于染色体水平组装参考的拟南芥组合平均可映射性为34%与35%，而含SNP注入参考的组合降至18%与14%。结果表明顺序使用单个基因组会给出虚假的可映射性印象，且种间嫁接较种内嫁接具更好区分潜力。
其二，以混合RNA数据集对mobileRNA进行基准测试。模拟数据可控制变量但常不反映真实生物学背景，故研究人员以真实非嫁接数据集加模拟移动RNA读段构建混合RNAseq数据集。在sRNA数据集分析中，150个模拟移动sRNA簇中，mobileRNA在茄子/番茄、Col-0/C24与Col-0/Ler-0组合分别回收约97%、60%与24%，性能与两基因型遗传相似性呈负相关；mobileRNA在各模拟中假阳性低于1%，而Li与Rubio方法在茄子/番茄组合分别达99%与约48%，在拟南芥模拟中均超98%。分层格式模拟显示mobileRNA性能基本不受表达水平影响，而Li与Rubio的漏检主要集中于低表达sRNA簇。在mRNA数据集分析中，以1k、5k、10k与50k读段掺入模拟最多150个移动mRNA，mobileRNA假阳性率低于7%；Li方法虽回收全部模拟转录本但假阳性达99%；在丰度估计上，mobileRNA相关性最高（茄子/番茄R2=0.59；Col-0/Ler-0 R2=0.012），优于其他方法。结果表明基于合并参考映射可强效降低假阳性噪声并更佳估计移动转录本真实丰度。
其三，比对后贝叶斯推断可补充mobileRNA对移动mRNA的检测。baymobil利用同源嫁接数据估计各SNP位置错误率，再评估异源嫁接数据中对应远缘基因型的SNP读段是否超出错误预期，其成功依赖足够数据估计基线错误率。在Col-0/Ler-0模拟数据中，仅37%（1k样本）至70%（50k样本）的SNP位置n>0，加之无表达基因占11%，数据稀疏缺乏统计效力。1k读段时mobileRNA检测28%的模拟转录本而baymobil为0；mobileRNA对文库大小不敏感，5k时为29%（44个转录本），10k与50k无新增；baymobil则随深度提升，5k、10k、50k分别回收19%、39%、64%。5k时mobileRNA检出的44个中仅6个（14%）被baymobil同时检出，10k与50k时升至48%与61%。mobileRNA可回收baymobil因信息不足而无法检出的移动RNA，不受参考等位基因表达约束，但受同源序列一致性百分比限制（β=?16.4，95% CI [?28.9, ?4.01]，z=?2.59，P<.01）。两者整合时，50k输入下可回收高达75%的移动mRNA且几乎无假阳性。
其四，对既往移动mRNA数据集的重分析。研究人员采用含重复与对照的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）接穗与番茄砧木的RNAseq数据，分析番茄砧木以检测源自接穗的移动mRNA。本氏烟草基因组可映射性指数为58.9%，合并参考中仅中度降至50.8%。运行mobileRNA鉴定出129个潜在移动mRNA，与原研究242个仅9个重合（单尾Fisher P=7.96e-07），虽高于随机预期但差异显著。两组列表均富集于运输相关生物学功能，mobileRNA检出者富集于细胞内蛋白质运输、1,3-β-D-葡聚糖合酶活性、金属离子结合与ATP结合。mobileRNA鉴定的移动转录本平均可映射性明显更高，提示原研究部分候选源自高重复区域而可能被错误归于本氏烟草并被误判为移动；BLAST显示mobileRNA候选与番茄基因组相似度更低，进一步支持其归属更准确。这些候选在砧木中积累量低于非移动mRNA且表达分布更均匀；mobileRNA检出的23%候选覆盖超过完整预测mRNA序列的75%，符合真实移动分子特征，且此前未被检出。结果表明mobileRNA在真实实验数据中可鉴定出更契合真实移动特征的候选转录本。
**讨论与结论** 移动RNA领域近期因可重复性与可靠性受到批评，对现有数据的重分析提示既往报道的移动mRNA相当部分可能是映射错误与技术噪声的产物。研究人员描述的mobileRNA是一款易用的Bioconductor/R包，提供鉴定多基因组来源sRNA或mRNA的预处理与分析流程；通过合并参考基因组消除单参考比对的模糊性，解决移动RNA检测的主要问题之一并降低假阳性风险，这种严格性可能解释了相较早期研究候选数量较少。关键步骤是在比对阶段使用合并参考，直接在映射步骤而非后处理中确定每条读段最可能的位置；类似策略已用于泛基因组比对、宏基因组研究、番茄杂种RNAseq比对及嫁接交界处异质材料中不同基因型来源RNA的区分。研究人员在混合数据集上评估多种移动RNA检测系统，该法对RNAseq与sRNAseq均表现良好，提供研究两类分子的标准平台；并发现当两基因组过于相似或测序覆盖度过低时检测效率下降。基因组可映射性分析揭示根本性限制：解析移动RNA的能力与嫁接伙伴序列相似性成反比；种内嫁接中独特可映射区域下降，提示许多移动转录本位于同源区域，标准短读长比对若无额外统计建模难以区分来源，这或可解释早年种内嫁接研究可靠性不足。基于此，研究人员建议将mobileRNA与baymobil结合：mobileRNA可作为主要发现引擎，尤其适用于可稳健唯一映射的种间嫁接；种内嫁接中mobileRNA正确报告低可映射性，此时整合baymobil可基于SNP检测RNA，该组合通过mobileRNA减少假阳性，并通过baymobil检测因映射模糊被mobileRNA舍弃的读段以减少假阴性与假阳性。尽管mobileRNA显著提升RNAseq数据检测移动RNA的准确性，其依赖的可映射性强烈取决于参考基因组质量及读段长度与质量；长读长测序对移动mRNA检测预期具显著优势，但成本更高且存在短读长数据遗产，故mobileRNA面向短读长RNAseq设计，未来版本可整合长读长数据以解析全长移动转录本。研究人员希望提供标准化流程以解决既往方法的不足并促进移动RNA领域的跨研究可比性；基准测试表明mobileRNA与baymobil组合检测移动mRNA的准确性高于其他方法。该流程已整合为Bioconductor上易用的R包，虽为检测嫁接实验中的移动RNA分子而开发，但不限于此应用，可作为标准RNAseq与sRNAseq分析的R接口。
