金属离子配位驱动环状排列II组内含子backsplicing的活性中心重塑

《Nucleic Acids Research》：Metal-ion coordination drives active-site remodeling for backsplicing in circularly permuted group II introns

　　

环状排列（CP）II组内含子是可自我剪接的核酶，其通过顺序进行的分支反应与backsplicing反应产生分支内含子与环状外显子（circRNAs）。尽管初始的分支步骤已在结构上得到表征，但调控随后大规模活性中心重塑及backsplicing所需严格金属离子特异性的机制原理仍知之甚少。本研究呈现了一系列来自^{Gluconacetobacter diazotrophicus} PAL5（Gdi-1）的CP II组内含子的高分辨率冷冻电镜（cryo-EM）结构，在不同的离子条件下捕捉了该核酶沿分支-to-backsplicing通路的离散阶段。在K⁺/Mg²⁺、K⁺/Ca²⁺与Cs⁺/Mg²⁺条件下的比较分析表明，有效的backsplicing依赖于调控3′剪接位点（3′SS）停靠与催化中心形成的离子特异性配位网络，揭示了精确的金属离子配位构象重排与动态剪接位点交换机制。关键的是，研究人员鉴定出一个此前未被认识、高度选择性的单价阳离子结合位点K3，其在结构上将γ–γ′相互作用与异核四金属核心的重装配偶联起来，从而促进有效的第二步活性中心形成。总之，这些发现为II组内含子催化过程中金属离子依赖的活性中心重塑建立了结构基础，并为circRNA生物发生中的金属离子选择性提供了机制性见解。

**研究背景** Ⅱ组内含子是广泛存在于细菌与真核生物细胞器中的自剪接核酶，根据保守结构基序与外显子识别机制分为IIA、IIB与IIC三个亚类。其中一类特殊亚群——环状排列（circularly permuted，CP）Ⅱ组内含子已在多种细菌谱系中被鉴定，其结构域呈独特重排：结构域IV（D4）的p1、p2亚结构域连同结构域V（D5）、结构域VI（D6）及3′外显子被移位至5′端，D4其余部分位于3′末端，致使外显子区被包埋于核酶核心内。此类内含子保留两步酯交换自剪接通路，但通过顺序的分支与backsplicing反应产生分支产物与环状外显子（circRNAs）。虽然初始分支步骤的结构已有解析，但后续大规模活性中心重塑及backsplicing对金属离子的严格要求，其机制原理仍不清楚。既往对IIC内含子的晶体学研究提示金属离子配位是第一步反应后重塑的关键决定因素，而γ–γ′三级相互作用与催化三连体的重组装也被认为参与第二步活性中心的装配，但二者如何协同偶联仍根本未解决。为此，研究人员以^{Gluconacetobacter diazotrophicus} PAL5来源的Gdi-1 CP Ⅱ组内含子为对象开展研究。**技术方法** 研究人员采用体外转录与纯化制备Gdi-1前体RNA，通过体外自剪接 assay（不同单价/二价离子组合及动力学分析）评估剪接效率；利用冷冻电镜（cryo-EM）在K⁺/Ca²⁺、K⁺/Mg²⁺、Cs⁺/Mg²⁺条件下解析全长RNA多个催化状态的高分辨率结构，并进行三维分类、精修与模型构建；结合定点突变与circRNA定量验证关键相互作用的功能。**研究结果** 一、Gdi-1 CP Ⅱ组内含子的离子依赖性结构状态：体外实验显示K⁺/Mg²⁺支持两步反应高效完成，K⁺/Ca²⁺允许分支但严重阻断backsplicing，Cs⁺/Mg²⁺可完成两步但减慢进程；冷冻电镜解析出八个结构，涵盖分支前、分支后、backsplicing前及分支产物等状态。二、D4两部分的可能功能：结构分析发现D4p1与D2、D4p2与D3形成kissing-loop相互作用，且存在广泛的ω–ω′三级相互作用；突变实验表明这些相互作用对剪接活性至关重要。三、从分支后到backsplicing前中间体的结构转变：分支后状态中5′SS被切割并形成bpA与G209间的2′–5′磷酸二酯键；向backsplicing前状态转变时bpA约旋转20 ?，3′SS经δ–δ′相互作用停靠；η-η′^up与η-η′^down分别稳定D6的上、下构象，突变实验支持其在剪接位点交换中的协同作用。四、催化核心周围的保守外围支架：六个结构比较显示外围RNA框架基本保守，M3、M5及K2等金属位点稳定该支架。五、分支反应中的状态依赖性金属离子配位：分支前状态中K1、K2、M1、M2构成异核四金属核心；分支后M1释放，M2仍与新生成的U208 3′-OH配位。六、向backsplicing前状态转变时异核四金属核心的重装配：K⁺/Mg²⁺与Cs⁺/Mg²⁺下K1重新占据原位；鉴定出仅见于backsplicing前中间体的单价离子位点K3；K⁺/Ca²⁺下M2位点无法稳定形成，Cs⁺/Mg²⁺下M1密度缺失。七、K3通过稳定γ–γ′相互作用促进活性中心装配：K3直接配位γ–γ′相互作用中的U134及邻近的G210，其网络延伸至C84凸出磷酸；γ–γ′破坏性突变显著降低circRNA生成，补偿性突变恢复近野生型水平。八、顺序性活性中心重塑偶联分支与backsplicing：研究提出分支后M1释放、bpA移位与D6重定位使3′SS停靠，随后K3网络建立并重装配四金属核心，外显子连接后M2释放。**讨论与结论** 讨论指出，两步酯交换对二价阳离子的需求显著不同：分支反应可在K⁺/Ca²⁺下进行，此时M1–M2距离达4.5 ?，超过双金属催化最佳间距（<3.9 ?）；而转向依赖Mg²⁺的backsplicing时催化中心明显压缩，M1–M2距离缩短至3.8 ?，Mg²⁺因半径更小、电荷密度更高更适合紧凑中心内的内球配位。单价离子同样参与第二步活性中心组织，K3稳定γ–γ′相互作用并营造有利于Mg²⁺配位的局部环境。与Gdi-1（K⁺/Ca²⁺）、截短的Cte-1突变体及IIC pre-2S结构的比较显示，这些结构均未采取完全优化的第二步催化RNA构架。研究结论为：分支到backsplicing的转变伴随RNA三级相互作用与金属离子组织的协同重塑，包括bpA从活性位点移位、经δ–δ′招募3′SS、γ–γ′区域组织及异核四金属核心重装配；单价离子组织催化构架而二价离子直接介导催化；该工作为Ⅱ组内含子催化中金属离子依赖的活性中心重塑建立了结构基础，并为circRNA生物发生中的金属离子选择性及可环化核酶的工程改造提供了机制框架。