单细胞染色质可及性遗传变异图谱揭示免疫细胞类型特异性调控与疾病风险机制

《Nature》：Genetic variants shape single-cell chromatin accessibility and disease risk

理解遗传变异如何在单细胞分辨率下塑造基因调控对于阐明复杂疾病机制至关重要，但此前受限于大规模单细胞多组学数据的缺乏。研究人员在此展示了来自1,042名供体、包含350万个外周血单核细胞（PBMC）的单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq）数据，并匹配了全基因组测序（WGS）数据。跨越28种免疫细胞类型，研究人员检测了440,996个染色质可及性峰，并鉴定出243,225个位于100,483个峰中的染色质可及性数量性状位点（caQTL），其中60%具有细胞类型特异性。罕见变异分析确定了38,161个关联峰，预测的转录因子结合破坏在单个位点中被发现。与来自单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（540万个PBMC）的表达数量性状位点（eQTL）进行共定位分析，定义了28,834个候选顺式调控元件（cCRE）。针对16种疾病和44种血液性状的全基因组关联研究（GWAS），caQTL比单独使用eQTL多定位了4.5%至22.6%的信号。结合细胞类型和组织特异性背景、远端效应及多因果变异模型，将GWAS-eQTL的一致性从约16%提升至约65%。细胞状态进一步调节遗传效应，超过200,000个caQTL-细胞状态相互作用中有27%缺乏主效应。在炎症性肠病（IBD）风险基因ADCY7处，可及性效应随CD4+ T细胞中的基因型和G蛋白介导通路活性而变化。一个基于eQTL和caQTL层训练的图神经网络（GNN）在未配对的多组学数据中推断峰-基因连接，其准确性比不依赖QTL的数据高出高达17.2%，额外发现了128个转录因子-靶标对（增加22%）。这些结果表明，遗传变异以细胞类型特异性和细胞状态特异性的方式塑造染色质可及性，从而影响免疫功能与疾病风险。

论文解读文章

一、研究背景与问题

尽管全基因组关联研究（GWAS）已识别出成千上万个与复杂疾病相关的风险位点，但绝大多数位于非编码区，其功能机制难以解析。传统策略是通过定位分子数量性状位点（molQTL），如表达数量性状位点（eQTL）来桥接这一鸿沟。然而，基于bulk RNA测序的eQTL研究对细胞类型特异性效应的敏感性较低，导致大量GWAS信号缺乏对应的调控效应，即所谓的“缺失调控”问题。染色质可及性数量性状位点（caQTL）作为直接反映调控元件物理状态的互补模态，能够捕获非编码变异对增强子和启动子活性的影响。已有研究表明caQTL比eQTL能与更多GWAS位点共定位，尤其是在远端元件上。但目前已有的caQTL图谱在规模或分辨率上仍有限，或依赖于从染色质数据中推算的基因型。此外，许多caQTL缺乏相应的eQTL，其原因尚不清楚，而动态的、细胞状态依赖的调控效应也常被忽视。因此，亟需大规模、高分辨率的单细胞染色质可及性遗传调控图谱，以系统性地解析非编码变异如何通过染色质层面的变化影响免疫功能和疾病风险。

二、研究内容与结论

本研究通过分析来自1,042名供体的350万个高质量外周血单核细胞（PBMC）核的单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq）数据，并结合匹配的全基因组测序（WGS）数据，绘制了首个大规模的单细胞染色质可及性遗传调控图谱。研究在28种免疫细胞类型中鉴定了243,225个caQTL，其中60%表现出细胞类型特异性效应。通过将caQTL与来自540万个PBMC的单细胞eQTL数据进行整合，定义了28,834个候选顺式调控元件（cCRE）。研究发现，caQTL在解释16种疾病和44种血液性状的GWAS信号方面优于eQTL，平均多定位4.5%至22.6%的信号，特别是在捕获远端调控效应方面。通过考虑细胞状态依赖性，研究还发现了大量缺乏主效应的caQTL-细胞状态相互作用。最终，利用QTL引导的图神经网络（GNN）框架，显著提升了峰-基因连接和基因调控网络（GRN）推断的准确性。该论文发表于《Nature》。

三、主要关键技术方法

1. 1.
   样本队列与数据生成：研究使用了TenK10K阶段I队列，主要包括来自塔斯马尼亚眼科生物库（TOB）的952名供体，以及BioHeart（BH）和液体活检生物库（LBIO）的少量样本。通过10X Genomics平台对所有样本进行了scATAC-seq，并对部分样本进行了多组学（RNA+ATAC）测序。
2. 2.
   caQTL定位：对922名供体的3,472,552个高质量核进行分析，在28种细胞类型中，针对440,996个染色质峰，测试了约900万个常见单核苷酸多态性（SNP）和340万个插入缺失标记（Indel），采用基于置换的校正方法鉴定显著caQTL。
3. 3.
   罕见变异分析与功能注释：使用SAIGE-QTL工具测试罕见变异（MAF<5%）的关联，并通过条件分析排除连锁的常见变异效应。利用深度学习模型ChromBPNet预测等位基因特异的染色质可及性，并鉴定转录因子结合基序的破坏。
4. 4.
   共定位与整合分析：使用coloc和基于汇总数据的孟德尔随机化（SMR）方法进行caQTL与eQTL、GWAS的共定位分析。应用SuSiE和多性状精细映射框架（mvSuSiE）处理多因果变异情况。使用CASTIE模型检测caQTL与细胞状态（伪时间）的相互作用。
5. 5.
   网络推断：采用基于图的GLUE框架，将caQTL和eQTL的汇总统计量作为先验知识，用于指导峰-基因连接和基因调控网络（GRN）的推断，并在独立数据集上进行基准测试。

四、研究结果

1. 常见变异单细胞caQTL的定位

研究人员在28种免疫细胞类型中鉴定出243,225个显著的caQTL，对应100,483个独特峰（caPeak）。约60%的caQTL表现出细胞类型特异性效应，这种特异性可能源于不同细胞类型在同一基因座上存在不同的因果变异。功能注释显示caPeak富集于增强子和启动子区域。通过SuSiE精细作图，大多数caQTL可被归入单一可信集。研究通过多种内部和外部方法验证了caQTL的高重复性和效应方向一致性。深度学习模型ChromBPNet对峰内精细定位变异的效应大小预测与实际观察值高度相关。

2. 罕见变异对染色质可及性的影响

利用SAIGE-QTL，研究在26种细胞类型中鉴定出216,159个罕见的caQTL。经条件分析排除与常见变异的连锁后，仍有62,866个罕见caQTL（对应38,161个独特峰）保持显著。通过ChromBPNet预测和贡献分数分析，研究示例性地展示了三个罕见变异如何通过破坏转录因子（如ELF1、CREB1）的结合基序，降低远端增强子的染色质可及性，进而与下游基因（如CLEC2D、KLF2、ITGB2）的表达下调相关联。

3. 细胞类型分辨的候选顺式调控元件的特征描述

通过coloc对caQTL和eQTL进行共定位分析，研究鉴定了76,754个共定位事件，涉及28,834个峰和11,204个基因，这些峰被定义为候选顺式调控元件（cCRE）。SMR分析进一步确认了其中约一半事件的因果调控关系。研究发现了516个双向cCRE，即同一峰在不同细胞类型中对不同基因具有相反的调控效应，例如MARCH8基因座的染色质峰在自然杀伤（NK）细胞和常规树突状细胞2型（cDC2）中表现出相反的调控方向。

4. 解决eQTL遗漏的GWAS位点

对16种疾病和44种血液性状的GWAS信号进行共定位分析，发现caQTL平均比eQTL多定位9.8%的GWAS位点。这种优势部分来源于caQTL能捕获更远端的调控效应（如ETS2位点），以及处理等位基因异质性（如ADCY7位点）。通过结合细胞类型分辨的caQTL/eQTL、扩大的顺式窗口（±1Mb）和多因果变异模型，能将炎症性肠病（IBD）的GWAS位点解释率从bulk eQTL分析时的约16%大幅提升至约65%。

5. 多组学精细定位疾病位点

应用多性状精细映射框架（mvSuSiE）整合IBD的GWAS、caQTL和eQTL数据，研究在21种免疫细胞类型中鉴定了1,085个可信集-表型对。该方法成功地将因果变异精细定位到特定基因座，例如11:1852991:C:T变异被确定为LSP1基因表达的因果调控变异，同时影响染色质可及性和IBD风险。

6. caQTL沿细胞状态轨迹的变化

利用CASTIE模型，研究在CD4⁺ T细胞中鉴定了209,189个显著的caQTL-伪时间相互作用，其中27.3%缺乏主效应。例如，在ADCY7基因座的一个峰，其可及性效应沿CD4⁺ T细胞分化轨迹呈基因型依赖性变化，并且与G蛋白介导的通路活性相关，揭示了静态分析无法捕获的动态调控模式。

7. QTL引导的峰-基因和基因调控网络推断

将caQTL和eQTL的汇总统计量作为先验信息引入GLUE框架，显著提升了峰-基因连接的推断准确性，特别是对远端峰（距转录起始位点[TSS] 75-100kb）。相比传统的基于共变异的SCENIC等方法，QTL引导的GLUE在独立验证集上表现更优。整合SMR和GLUE的结果，额外发现了128个转录因子-靶基因对，其中66个位于疾病GWAS位点，丰富了基因调控网络。

五、总结与讨论

本研究证实，遗传变异以细胞类型特异性和细胞状态特异性的方式塑造染色质可及性，从而影响免疫功能与疾病风险，捕获了大量单纯转录组方法所遗漏的调控效应。caQTL能比eQTL更好地解释GWAS位点，尤其是在远端调控方面，这有助于填补“缺失调控”的空白。潜在机制包括：可及性改变发生在静息或预备状态的元件上而不立即驱动转录；转录因子结合受限于稀有或发育状态；或可及性变化在转录后被缓冲。

研究也存在局限性：caQTL的定位依赖于峰的定义，不同平台和算法会影响跨研究比较；caQTL的统计功效受顺式窗口大小影响，需要更宽窗口（如±1Mb）以捕获长距离调控；细胞类型注释缺乏金标准；染色质可及性仅反映了调控的一维，整合组蛋白修饰、DNA甲基化和蛋白表达将提供更全面的视角；对静息细胞的依赖可能掩盖刺激诱导的效应；结构变异和串联重复序列也可能揭示SNP/Indel分析无法发现的调控机制。

综上所述，这些结果确立了染色质可及性是非编码变异作用于免疫细胞功能和疾病风险的关键层面，并表明在细胞类型分辨率下测量它能够恢复仅凭表达数据无法解释的调控机制。