《International Journal of Hydrogen Energy》：Biohydrogen production via two-stage lactate-driven dark fermentation: A long-term operational performance study
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将化石碳转化为能源仍然是人为温室气体排放的主要来源，也是气候变化的主要驱动因素[1]。因此，提高可再生能源在全球能源系统中的占比已成为向更可持续、更低碳经济转型的核心目标。在此背景下，可再生氢日益被视为一种有前景的能源载体，尤其适用于直接电气化在
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将化石碳转化为能源仍然是人为温室气体排放的主要来源，也是气候变化的主要驱动因素[1]。因此，提高可再生能源在全球能源系统中的占比已成为向更可持续、更低碳经济转型的核心目标。在此背景下，可再生氢日益被视为一种有前景的能源载体，尤其适用于直接电气化在技术或经济上不可行的难脱碳行业。鉴于化石燃料仍占全球一次能源消费的近75%[1]，这一转型尤为重要。根据当前定义，氢只有在完全由可再生能源生产时才能被视为“可再生”，无论是作为非生物来源的可再生燃料（如通过可再生电力驱动的电解产生的氢），还是通过生物质的生化转化获得[2]。在这方面，由微生物菌群将有机底物转化产生的生物源氢代表了一种有吸引力的可再生能源载体，因为它兼具能源回收、废弃物增值和循环生物经济路径开发等多重优势。
暗发酵（DF）是指将富含碳水化合物的有机底物在厌氧、无光条件下生物转化为生物源氢的过程[3]。该过程为有机废弃物增值提供了一条实用途径，同时在产氢的同时生成一系列有价值的副产品，包括有机酸、醇类和生物源二氧化碳。与光发酵相比，DF通常能实现更高的体积产氢速率（HPR），且所需反应器构型相对简单。这些优势推动了DF向经济可行且可规模化技术方向发展的持续努力[4]，[5]。近期研究表明，产氢效率受主导发酵途径的强烈影响，其中乳酸驱动DF（LD-DF）已成为与强化产氢相关的重要途径[3]，[6]，[7]，[8]，[9]，[10]。在LD-DF系统中，乳酸菌（LAB）与乳酸氧化产氢菌（LO-HPB）通过交叉喂养机制相互作用，将乳酸导向产氢途径[11]，[12]。LD-DF的一个关键特征是消耗乳酸的菌群可将LAB产生的乳酸重新导向产氢途径，从而限制乳酸积累及相关代谢失衡。LD-DF还被报道通过改善生物质截留和水解活性来增强底物转化，同时通过污染控制、酚类化合物解毒和pH调节等机制增强工艺稳健性[11]。
LAB与LO-HPB之间的关联并非仅仅是实验室现象，而是反映了在植物相关环境、厌氧生态系统以及人类和动物胃肠道微生物群中自然发生的基于乳酸的交叉喂养相互作用[11]。在LD-DF系统中，乳酸稳态要求LAB的乳酸产生与LO-HPB的乳酸消耗保持协调，从而维持交叉喂养、互养生长和产氢[12]，[13]，[14]，[15]，[16]。然而，这些相互作用在长期连续运行中的持续性无法预先假定。在单级连续LD-DF系统中，初级和次级乳酸发酵同时发生，维持乳酸稳态尤为困难。这些微生物相互作用可能受到底物竞争、LAB驱动的酸化、细菌素介导的抑制以及pH、有机负荷率（OLR）或水力停留时间（HRT）等操作参数变化的影响。在长期运行过程中，竞争机制可能胜过合作机制，破坏乳酸产生与消耗之间的平衡。由此产生的生态失衡可能导致乳酸积累、发酵产物谱改变和HPR降低[17]，[18]。
为此，研究人员提出了多种策略以增强LD-DF性能并将代谢平衡导向产氢。这些策略包括使用具有已验证LD-DF活性的接种物[19]、LAB和/或LO-HPB菌群的生物强化[14]，[20]，[21]、底物预发酵以将部分可发酵碳水化合物转化为乳酸[7]，[8]，[13]，[16]，[22]，以及调整操作参数（尤其是pH和HRT）以支持微生物相互作用并有利于乳酸产生和氧化[23]。在此框架下，研究人员提出了一种两级LD-DF构型，由两个在不同条件下运行的连续搅拌釜反应器（CSTR）组成，以改善对乳酸驱动产氢所涉及的代谢相互作用的控制[9]，[18]。该构型实现了乳酸产生与其后续转化为氢在物理和功能上的分离。在实际运行中，第一反应器在促进LAB生长和乳酸形成的条件下运行，而第二反应器在有利于LO-HPB活性、乳酸氧化和产氢的条件下运行。
尽管取得了上述进展，关于两级LD-DF系统能否在长期连续运行中保持乳酸产生与氧化之间的功能分离，现有证据仍然有限。为弥补这一知识空白，研究人员以合成食物垃圾（FW）为原料，对由两个串联CSTR组成的连续两级LD-DF系统进行了180天评估。受控底物最大限度地减少了成分变异性，使工艺行为能够在可重复的进料条件下得到评估。研究人员考察了HPR、气相氢含量、发酵产物谱和微生物群落结构的时间变化，同时评估了系统对操作扰动的响应。通过整合这些维度，本研究评估了两级LD-DF的长期运行、代谢和生态动态，并识别了长期连续运行中出现的关键限制因素。
论文解读
一、研究背景与科学问题
化石碳转化为能源仍是人为温室气体排放的主要来源，推动可再生能源在全球能源系统中的占比提升已成为向低碳经济转型的核心目标。在此背景下，可再生氢被视为有前景的能源载体，尤其适用于难以直接电气化的行业。生物源氢通过微生物菌群将有机底物转化产生，兼具能源回收、废弃物增值和循环生物经济开发等多重优势。
暗发酵（DF）是在厌氧、无光条件下将富含碳水化合物的底物转化为生物源氢的过程，相比光发酵具有更高的体积产氢速率（HPR）和更简单的反应器构型。近年研究表明，乳酸驱动DF（LD-DF）是与强化产氢相关的重要途径，其中乳酸菌（LAB）与乳酸氧化产氢菌（LO-HPB）通过交叉喂养机制相互作用，将乳酸导向产氢途径。然而，在单级连续LD-DF系统中，初级和次级乳酸发酵同时发生，维持乳酸稳态尤为困难。长期运行中，竞争机制可能胜过合作机制，导致乳酸积累、发酵产物谱改变和HPR降低。
为增强LD-DF性能，研究人员提出了两级LD-DF构型，由两个连续搅拌釜反应器（CSTR）串联组成，实现乳酸产生与后续产氢在物理和功能上的分离。然而，关于两级系统能否在长期连续运行中保持功能分离的证据仍然有限。为弥补这一知识空白，本研究以合成食物垃圾（FW）为原料，对两级LD-DF系统进行了180天连续运行评估。
二、研究内容与主要结论
本研究构建了一个由两个1.2-L CSTR串联组成的两级LD-DF系统，以合成FW为底物连续运行180天。产乳酸反应器（R1）以FW自身微生物群接种，在酸性条件下富集乳酸产生菌；产氢反应器（R2）以经热预处理的中温厌氧发酵消化液接种，在pH 6.5条件下运行。整个实验分为四个阶段，逐步缩短HRT并在第97天启动R1的pH控制（设定值4.5）。
研究得出以下主要结论：第一，两级系统在180天连续运行中维持了稳定的产氢性能，各阶段代表性HPR为2.02～2.65 NL H?/L-d，氢含量为34.81%～39.90%；第二，R1中乳酸为主要代谢产物，R2中乳酸几乎被完全消耗，丁酸是R2中最丰富的可溶性代谢产物；第三，系统在泵故障后无需重启或重新接种即可恢复产氢，展现了良好的恢复能力；第四，R1和R2的微生物群落随运行时间逐渐趋同，R2中乳酸菌相关属增加而Prevotellaceae下降。
三、关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：使用合成食物垃圾作为受控底物，配方为马铃薯（78%）、鸡胸肉（14%）、卷心菜（4%）和猪油（4%，w/w），经高压灭菌和均质化后稀释至总固体（TS）50 g/L；R1以FW自身微生物群接种，R2以经90°C热预处理20分钟的中温厌氧发酵消化液接种并在乳糖基培养基中活化；采用气相色谱-热导检测器（GC-TCD）测定气体中氢浓度，采用高效液相色谱（HPLC）测定有机酸浓度，采用苯酚-硫酸法测定总碳水化合物浓度，pH、总碱度、TS、挥发性固体（VS）和总凯氏氮（TKN）按标准方法测定；微生物群落结构通过16S rRNA基因扩增子测序表征，使用DADA2在QIIME 2中降噪生成扩增子序列变异体（ASVs），基于SILVA 138.1数据库进行分类学注释；采用主成分分析（PCA）探索操作参数、代谢物浓度与R2中优势菌属相对丰度之间的关系。
四、研究结果
3.1 两级LD-DF系统的运行性能
通过180天连续监测R2中的沼气产率、HPR、氢产率（HY）和氢含量，研究发现R1中未检测到产氢，沼气产量极低，表明同型乳酸发酵在该条件下占主导。R2在启动后迅速建立产氢活性。各阶段代表性平均HPR为2.02～2.65 NL H?/L-d，其中第一阶段最高（2.65±0.57 NL H?/L-d），第二阶段因HRT缩短2小时而下降约24%至2.02±0.56 NL H?/L-d。HY从第一阶段的27.46±6.73 NmL H?/g VS降至第二阶段的17.74±6.07 NmL H?/g VS，此后维持在约17 NmL H?/g VS。R1启动pH控制后HPR和HY未发生显著变化。研究指出，由于顺序实验设计，HRT、OLR、pH和运行时间等变量相互混杂，阶段间差异应视为综合条件下的时间关联而非独立因果效应。
3.2 两级LD-DF系统中的液相代谢产物谱
通过分析R1和R2中乳酸和挥发性脂肪酸（VFAs）的时间变化，研究发现乳酸是R1中的主要代谢产物，第一阶段平均浓度为7.32±0.77 g/L，随后降至5.87±0.99 g/L。R2中乳酸几乎被完全消耗，仅在产氢不稳定期间出现零星升高。丁酸是R2中最丰富的可溶性代谢产物，浓度常在5～7 g/L之间，与产氢混合培养中丁酸相关乳酸转化途径占主导的报道一致。碳水化合物去除分析显示，R1平均去除进料碳水化合物的27%～29%，R2进一步去除69%，系统总碳水化合物去除率约97%。与文献报道的两级LD-DF系统（R1去除约76.9%）相比，本研究中R1的碳水化合物转化率较低，表明R1的运行条件未针对碳水化合物向乳酸转化进行优化。
3.3 长期运行中两级LD-DF系统的产氢稳定性
研究采用产氢稳定性指数（HPSI）评估代表性运行期间产氢的时间一致性。基于HPR的HPSI值在四个阶段分别为0.79、0.72、0.80和0.81，基于氢含量的HPSI值分别为0.90、0.93、0.91和0.90，表明气相氢组成比HPR更为一致。第54天发生的泵故障导致两个反应器损失大量工作体积并引起HPR骤降，恢复运行后HPR在三天内恢复到扰动前水平的约65%，随后达到第三阶段最高值3.08 NL H?/L-d，且无需反应器重启或重新接种。第135～140天检测到气体管线泄漏，修复后产氢恢复但未出现类似泵故障后的恢复峰值。第81～96天出现的HPR持续下降未发现明确技术原因，被认定为真实的非稳态响应。研究强调HPSI仅描述代表性运行期间的时间一致性，不能作为整体工艺稳定性的独立验证。
3.4 两级LD-DF系统中的微生物群落结构
通过16S rRNA基因扩增子测序表征了R1和R2及其接种物来源的微生物群落。FW接种物以肠杆菌科（Enterobacteriaceae，64.97%）和芽孢杆菌科（Bacillaceae，26.59%）为主。R2富集接种物以梭菌科（Clostridiaceae，25.87%）和肠杆菌科（33.25%）为主，同时检测到乳杆菌科（Lactobacillaceae，18.69%）和普雷沃氏菌科（Prevotellaceae，14.28%）。R1中乳酸菌属（如Latilactobacillus、Lactobacillus和Fructilactobacillus）在运行早期富集，第二阶段乳杆菌科占69.37%。第三阶段末期出现群落结构转变，Prevotella（29.87%）和Subdoligranulum（8.40%）相对丰度急剧增加，与乳酸产量下降和HPR降低相吻合。R2中第一阶段Prevotella（37.91%）和Clostridium sensu stricto 1（12.35%）丰度较高，但Clostridium sensu stricto 1在第二阶段几乎消失。第三阶段Prevotella（52.39%）和Subdoligranulum（24.15%）占主导。第四阶段R2中乳酸菌相关属增加（Fructilactobacillus 33.31%，Lactobacillus 30.34%），而Prevotellaceae降至5.59%。值得注意的是，R1和R2的微生物群落从初始的明显差异逐渐趋同，这与R1启动pH控制后pH差异缩小相吻合。PCA分析显示PC1和PC2分别解释31.91%和29.33%的总方差，HPR与丁酸浓度最紧密相关，而Prevotella向量方向与HPR相反。
五、讨论与结论
研究讨论部分指出，本系统在实现的HPR水平下尚不能被视为优化的独立产氢技术，其实际意义在于将可再生氢生产与富含碳水化合物的有机残余物的处理和增值相结合。未来研究应优化R1和R2的运行条件、评估更高有机负荷率，并确定使用真实FW时能否维持长期运行。研究的主要局限性在于顺序实验设计无法分离HRT和pH的独立效应，HRT缩短同时提高了OLR并作用于两个反应器，而R1的pH控制仅在最后阶段引入，导致HRT、OLR、pH、运行时间和微生物演替部分混杂。R1中较低的碳水化合物转化率将产乳酸阶段确定为主要优化靶点。
研究结论部分可概括为：两级LD-DF系统在180天连续运行中维持了持续的产氢能力，各阶段代表性HPR为2.02～2.65 NL H?/L-d；系统在泵故障等扰动后无需重启或重新接种即可恢复产氢，展现了良好的恢复能力；R1被确定为工艺优化的主要靶点，其碳水化合物转化率较低限制了乳酸供应；R2中乳酸菌相关属在运行后期增加而Prevotellaceae下降，与HPR的有限改善相吻合；本研究的主要贡献在于验证了两级LD-DF系统在长期连续运行中的可持续操作性和恢复能力，而非最大化产氢速率。
