超声辅助限制性酶解对棉籽蛋白结构、流变学及技术功能特性的影响

《Industrial Crops and Products》：Ultrasound-assisted limited enzymolysis of cottonseed protein: Structural, rheological, and techno-functional attributes

　　

本研究探讨了超声辅助限制性酶解对棉籽蛋白（cottonseed protein，CP）结构、流变学及技术功能特性的影响。采用原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）、紫外-可见吸收光谱（UV-Vis absorption spectroscopy）、内源荧光光谱（intrinsic fluorescence spectroscopy）、游离巯基（free sulfhydryl groups，SHs）和二硫键（disulfide bonds，SSd）含量分析、流变学测定、浊度、持脂力（fat-holding capacity，FHc）与持水力（water-holding capacity，WHc）、乳化特性及起泡特性等手段，系统表征了超声（320 W，20/60 kHz，20 min）与碱性蛋白酶限制性酶解（10、20、30、40 min）单独及联合处理对CP结构、理化及功能特性的影响。结果表明，酶解破坏了CP亚基间的相互作用力，紫外-可见光谱揭示CP水解产物分子柔性增加；超声与酶解联合处理加剧了CP巯基基团的暴露，并显著降低了CP的黏弹特性；超声与30 min酶解的协同作用使CP的乳化稳定性达到最大。雷达图、主成分分析（principal component analysis，PCA）及Pearson相关分析揭示了CP结构、理化与功能特性间的内在关联。研究认为，超声空化辅助限制性酶解是一种有前景的蛋白改性技术，可将CP转化为适用于液体及乳液基食品体系的高功能性配料。

**研究背景** 随着可持续发展和健康饮食理念的普及，植物副产物来源的新型蛋白受到学术界和工业界的广泛关注。棉籽粕蛋白（cottonseed protein，CP）因成本低、产量高、营养品质优良及氨基酸组成均衡，被视为动物蛋白的潜在替代或补充来源，且已被报道具有抗氧化、抗高血压和抗菌等生物活性。然而，CP在食品体系中的应用仍受限于其较差的功能特性，这主要归因于其球蛋白亚基（7S和11S）复杂的三级和四级构象、紧密的分子结构、高分子量及低分子柔性。酶解可有效改变植物蛋白构象从而改善功能特性，但过度水解会产生具有不良风味的纳米级肽段且功能特性较弱。限制性酶解可诱导蛋白构象展开，促使原本埋藏的疏水簇暴露于分子表面，增加可电离基团并降低分子量，被认为是制备功能性优于天然蛋白的CP水解产物的可行策略。然而，传统酶解存在反应时间长、效率低等问题，可能与底物与酶之间接触频率低有关。超声作为一种新兴技术，在提高酶解效率及水解产物功能性方面展现出显著潜力，但其在CP这一可持续但利用不足的蛋白资源上的应用尚未广泛开展，超声辅助限制性酶解对CP结构特征、流变行为及功能特性的影响尚未被系统量化探索。因此，本研究旨在探究超声与酶解联合改性对CP分子结构及黏弹特性的影响，并考察联合处理后CP的理化与功能特性，同时采用雷达图、主成分分析（PCA）和Pearson相关分析阐明各处理条件下CP结构、理化与功能特性间的关系。

**关键技术方法** 研究人员以棉籽粕（蛋白含量40.01%，购自江苏嘉汇饲料有限公司）为原料，经等电点沉淀法（pH 4.5）提取CP（蛋白含量85.01 ± 2.64%），以碱性蛋白酶（活性178,000 U/mL，购自南京晨仪化学有限公司）进行限制性酶解。超声处理采用5 L超声浴（DZ-YX-22型，20/60 kHz同时工作模式，320 W，20 min，脉冲5 s开/2 s关，25 °C）。主要表征技术包括：原子力显微镜（AFM）观察微观形貌；紫外-可见吸收光谱（200–400 nm）；内源荧光光谱（激发波长280 nm，发射扫描290–450 nm）；DTNB法测定游离巯基（SHs）和二硫键（SSd）含量；流变仪测定储能模量（G′）、损耗模量（G″）及表观黏度；浊度测定（600 nm）；持脂力（FHc）和持水力（WHc）测定；乳化活性（EA）和乳化稳定性（ES）测定；起泡能力（FA）、起泡稳定性（FS）及泡沫形态显微观察。采用Minitab 18.0进行Tukey检验（p < 0.05），OriginPro 2024绘制雷达图、相关分析及PCA。

**研究结果**

**AFM表征** 通过原子力显微镜观察发现，天然CP呈紧密团聚结构；超声处理后微结构部分松散、颗粒减小且分布更均匀；酶解使CPH样品微结构崩解、颗粒变小，以CPH30最为显著；但CPH40出现团聚，可能与长时间酶解后小分子肽积累增加离子强度和渗透压、削弱静电排斥有关；联合处理较单独酶解产生更碎片化和无序的结构，颗粒直径和高度进一步降低，表明联合处理更有效地破坏了分子间相互作用和交联。

**紫外-可见吸收光谱** 通过紫外-可见光谱分析发现，CPH样品在约270 nm处吸收强度高于天然CP，表明酶解促进蛋白展开和低分子量基团暴露；但CPH40吸收峰降低，提示长时间酶解导致肽键进一步断裂及多肽间疏水缔合使已暴露基团重新埋藏；超声辅助酶解显著增强吸收强度，以CPH30-US最为突出，表明超声空化和微流束进一步促进CP构象展开和解离。

**荧光光谱** 通过内源荧光光谱分析发现，酶解使CP峰位最大波长（λm）由341 nm红移至343–347 nm，荧光强度显著高于天然CP，以CPH30最高（4999.68）；CPH40荧光强度下降，可能与肽间非共价相互作用导致芳香基团重新埋藏或荧光基团氧化修饰有关；超声辅助酶解引起更显著的红移和荧光强度增强，表明联合处理更有效地破坏分子核心疏水相互作用，增加暴露的疏水位点。

**游离巯基与二硫键含量** 通过DTNB法测定发现，酶解样品SHs含量显著高于对照（p < 0.05），以CPH30最高；SSd含量则呈相反趋势，酶解10–40 min样品SSd较对照（47.13 ± 1.82 μmol/g）分别降低27.75%、34.97%、61.66%和55.61%；CPH40较CPH30 SHs降低而SSd升高，提示过度酶解促使暴露活性基团间相互作用引发分子再聚集；超声显著提高天然CP及各水解产物的SHs含量并降低SSd含量（p < 0.05），归因于空化产生的高压、湍流和剪切流部分展开紧密蛋白构象。

**流变学特性** 通过流变学测定发现，所有CP和CPH溶液的G″始终低于G′，表现为以弹性为主的类固体行为；酶解样品G′和G″低于天然蛋白，顺序为CP > CPH10 > CPH20 > CPH40 > CPH30，表明酶解诱导部分展开破坏分子间离子键和氢键；联合处理进一步降低G′和G″；所有样品表观黏度随剪切速率增加而降低，呈典型剪切稀化行为；CPH样品黏度低于CP，但CPH40黏度高于CPH30，与过度酶解诱导的构象变化促进共价交联和非共价缔合有关；超声显著降低CP黏度，联合处理较单独处理进一步降低黏度。

**浊度** 通过浊度测定发现，天然CP浊度值（1.14 ± 0.038）为酶解样品的1.93–7.04倍（p < 0.05）；CPH30浊度最低（0.16 ± 0.009），可能与酶解后表面电荷增强、颗粒间排斥加强及肽键广泛断裂生成较短肽链有关；超声辅助酶解进一步降低CP分散液浊度，归因于超声化学作用削弱分子间疏水和静电缔合并促进肽键断裂。

**持脂力与持水力** 通过FHc和WHc测定发现，酶解样品FHc显著低于天然蛋白（p < 0.05），归因于蛋白降解减少与非极性残基数量；超声使CP和CPH的FHc显著提高（p < 0.05），以CP-US最高（3.78 ± 0.08 g/g），与空化诱导蛋白展开暴露埋藏疏水氨基酸残基有关。酶解使WHc由天然CP的2.51 ± 0.12 g/g提高至3.34–3.95 g/g，归因于极性基团暴露增加及较小肽亚基生成；超声进一步提高CP和CPH的WHc（p < 0.05），以CPH30-US最高，表明超声部分展开蛋白链增加极性残基可及性。

**乳化特性** 通过EA和ES测定发现，天然CP的EA（23.72 ± 1.95 m2/g）和ES（17.84 ± 0.98 min）较低；限制性酶解显著提高EA和ES（p < 0.05），分别在40 min和30 min达最大值；CPH40的ES低于CPH30，提示过度酶解可能不利于乳液稳定；超声使CP和酶解样品的EA和ES分别提高8.32–23.03%和10.72–26.19%，归因于空化效应改变三级构象、促进无序结构形成及降低黏度有利于界面吸附和扩散。

**起泡特性与形态** 通过起泡特性测定和显微观察发现，酶解样品起泡能力较天然蛋白提高42.86–53.84%（p < 0.05），以CPH30最佳；CPH40起泡能力下降，与两亲性肽凝聚性、柔性和表面活性降低有关；联合处理使起泡能力较单独酶解提高1.16–1.27倍。起泡稳定性呈相反趋势，天然CP最高（80.66%），酶解及联合处理均降低FS，归因于界面膜黏弹强度降低、膜厚度减小及气泡聚并；天然CP的FS显著高于商用大豆分离蛋白（约62–70%）。泡沫显微形态显示联合处理样品气泡较大，与其起泡能力增强但稳定性降低相一致。

**雷达图分析** 通过雷达图分析发现，天然CP在浊度、SSd含量、FS和FHc方面值最高；酶解重塑了性能层级，CPH30在UV/荧光强度、FA、ES和WHc方面显著增强；超声增强了酶解效果，CPH30-US在UV/荧光强度、SHs、FA、ES和WHc方面均达最大值，归因于超声破坏三级结构促进酶对内部键和切割位点的可及性。

**相关分析** 通过PCA和Pearson相关分析发现，PC1和PC2共解释90.0%的总变异；PC1主要由FA、ES、EA、FHc、UV强度和WHc正向驱动，FS、SSd和浊度负向载荷；PC2由FHc和λm主导；得分图将样品分为四组；UV吸收和荧光强度与浊度和SSd降低相关；SHs与SSd（r = -0.97）和浊度（r = -0.95）呈负相关；WHc增强对EA、ES和FA的改善贡献分别为85%、96%和95%。

**讨论与结论** 本研究考察了超声空化辅助酶解对CP结构、流变学、理化及功能特性的影响。AFM、紫外-可见吸收光谱、内源荧光、游离巯基和二硫键分析表明，联合处理较单独超声或酶解更显著地改变了CP分离物的分子构象。经超声与酶解序贯处理的CP分离物（CPH-US样品）较其他处理表现出降低的黏弹特性、黏度、浊度、持脂力和起泡稳定性；然而，联合处理较对照和单独酶解显著改善了WHc、起泡能力和乳化特性。相关分析揭示了CP和CPH样品结构、物理与功能特性间的强关联。上述结果表明，超声空化辅助酶解是一种有前景的技术，可将CP改性为适用于液体和乳液基食品体系（如饮料、酱料和婴幼儿配方食品）的高功能性配料。为实现其商业潜力，未来研究应聚焦于含改性CP终产品的感官特性和稳定性评价。