《Industrial Crops and Products》：Engineering phytochemical co-production through interspecific co-cultivation of
Quillaja saponaria and
Aristotelia chilensis in temporary immersion bioreactors (TIBs)
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通过种间共培养（interspecific co-cultivation），在临时浸没生物反应器（Temporary Immersion Bioreactors, TIBs）中实现了皂树（Quillaja saponaria）与马基莓（Aristotelia
通过种间共培养（interspecific co-cultivation），在临时浸没生物反应器（Temporary Immersion Bioreactors, TIBs）中实现了皂树（Quillaja saponaria）与马基莓（Aristotelia chilensis）的皂苷相关代谢物（saponin-related metabolites, SRM）与苯丙烷类相关代谢物（phenylpropanoid-related metabolites, PRM）的双重生产。物种比例与脱落酸（abscisic acid, ABA）诱导能够实现对植物化学 profiles 的靶向调控。胞外代谢物与氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity, ORAC）的动态变化提示存在优化代谢物回收与生产时机的机会。
一、研究背景与问题提出
植物来源的次生代谢产物需求日益增长，推动了可控、可规模化生物技术平台的发展。传统基于野生采集或田间种植的生产方式受季节、环境波动、长周期、代谢物含量不均以及部分物种野生资源压力等问题制约。体外植物培养技术可在可控环境与营养条件下实现生物量生产，并通过培养参数与诱导策略调控代谢响应。临时浸没生物反应器（Temporary Immersion Bioreactors, TIBs）因其间歇性液-气接触、高效营养与水分供应及改善的气体交换能力，特别适合分化植物组织的培养，已被广泛研究用于植物繁殖及次生代谢物可控积累。
皂树（Quillaja saponaria）与马基莓（Aristotelia chilensis）是智利本土木本物种，二者代谢特征显著不同但具有潜在互补性。马基莓富含酚类化合物，包括花青素及其他多酚；皂树则以结构复杂的三萜皂苷为特征，在制药、营养、化妆品及疫苗领域具有应用价值。近年来，皂树细胞培养已被证明可生产与树皮来源材料化学和生物学特性相当的QS-21，支持了高价值皂树皂苷可控体外生产的可行性。马基莓的TIB培养平台也已建立，并证明脱落酸（abscisic acid, ABA）可在受控培养条件下增强苯丙烷类积累。
尽管单一物种的体外培养已取得显著进展，但大多数生物技术过程仍围绕单培养体系组织，各物种与代谢产物分别生产。种间共培养提供了一种替代策略，即在共同培养环境中维持不同植物物种或组织。已有研究表明，人参（Panax ginseng）与紫锥菊（Echinacea purpurea）不定根在气升式生物反应器中共培养可同时生产人参皂苷与咖啡酸衍生物；淡紫锥菊（Echinacea pallida）与紫锥菊（E. purpurea）不定根共培养也表明物种组合与培养条件影响生物量、酚类、咖啡酸衍生物及抗氧化活性。然而，这些研究主要涉及不定根、草本物种或代谢相关体系，关于系统发育距离较远、具有不同次生代谢特征谱的木本物种在临时浸没系统中的同时培养信息仍然有限。
基于上述背景，研究人员提出假设：皂树与马基莓可在TIBs中同时维持并保留各自特征性次生代谢物谱，且相对接种比例的变化可改变皂苷与苯丙烷类富集产物之间的平衡；ABA诱导可提供额外的调控层次；部分积累的代谢物可被检测于培养基中，为下游回收创造机会。该研究旨在建立皂树与马基莓的种间TIB共培养体系，优化BAP条件以建立生物量，评估ABA诱导与物种比例对皂苷及苯丙烷类相关代谢物积累的影响，评估其在生物量与培养基之间的分布，并表征抗氧化能力的时间动态。
二、研究内容与结论
研究结果表明，1 mg L?1的6-苄氨基嘌呤（6-benzylaminopurine, BAP）是皂树与马基莓在TIBs中生物量积累的最适条件，共培养体系在该条件下表现出与各单培养相当的生长响应，表明同时培养未造成整体生长损害。ABA诱导实验显示，2 mg L?1 ABA在培养中期（第7至15天）显著促进皂苷相关代谢物（SRM）积累，并于第21天达到最高浓度；1 mg L?1 ABA则呈现更渐进的增加，最终SRM水平与2 mg L?1处理相当。对于苯丙烷类相关代谢物（PRM），1 mg L?1 ABA产生最高最终积累，第7天后显著增加，第21天左右达到最大值；2 mg L?1处理也增加PRM积累但最终值较低。
物种比例实验表明，1QS:2AC处理与较高的PRM积累相关，约为1QS:1AC处理的两倍，并显著高于单培养对照；2QS:1AC处理则显著增加SRM积累，达到所有处理中的最高值，同时PRM积累较低。1QS:1AC处理显示两种代谢物组的中间水平。值得注意的是，2QS:1AC处理的SRM值高于以200个外植体建立的皂树单培养对照，1QS:2AC处理的花青素含量也超过相应单培养，提示可能存在共培养效应或实验间变异。
SRM与PRM均在培养基中被检测到。含较高皂树比例的处理中SRM更丰富，含较高马基莓比例的处理中PRM更丰富，表明物种相关的代谢差异也反映在胞外部分。ORAC抗氧化能力的时间动态显示，田间生长马基莓对照从第0天的12.3 μmol TE g?1 FW持续下降至第30天的1.9 μmol TE g?1 FW，下降约85%；TIB生长马基莓对照从9.3下降至5.5 μmol TE g?1 FW。相比之下，1QS:2AC共培养处理从10.2逐步增加至15.9 μmol TE g?1 FW，增加约56%，为培养期末最高值，自第20天起显著高于对照处理。1QS:1AC处理在第20天达到11.5 μmol TE g?1 FW后下降至第30天的9.4；2QS:1AC处理在第20天达到10.5后降至9.2。
三、主要技术方法
该研究使用的主要技术方法包括：临时浸没生物反应器（TIBs）培养系统，采用SETIS?反应器，每6小时浸没4分钟；香草醛-硫酸比色法测定总三萜皂苷含量，以齐墩果酸为校准标准，结果以mg齐墩果酸当量每克干重（mg OAE g?1 DW）表示；直接紫外-可见分光光度法测定总花青素含量，使用矢车菊素-3-葡萄糖苷外标校准曲线，结果以mg C3G g?1 DW表示；氧自由基吸收能力（ORAC）测定，基于AAPH产生的过氧自由基对荧光素的氧化抑制，以Trolox校准曲线定量，结果以μmol TE g?1 FW表示。植物材料来源于智利利纳雷斯省Quero地区自然种群，每个物种选择一株母本植株，采集15个茎段在沸石基质中繁殖，建立体外克隆系CenBIO-QS2011（皂树）与CenBIO-AC2001（马基莓）。共培养实验中，每个反应器总外植体数固定为200个，物种比例通过分配外植体实现（1:1=100+100；1:2≈67+133；2:1≈133+67）。每个处理使用三个独立反应器，每个反应器采集四个样本。
四、讨论与结论
讨论部分指出，该研究建立了皂树与马基莓在TIBs中的种间共培养体系，物种比例与ABA诱导构成双变量过程框架。物种比例通过改变两种代谢系统的相对贡献来调控植物化学谱，ABA浓度则进一步调节代谢物积累，且两种代谢物类别对诱导处理表现出不同响应。胞外代谢物的检测提示液体培养阶段可作为潜在回收流，但机制（主动转运、分泌、被动扩散或胁迫相关释放）尚未确定。ORAC时间动态的差异表明共培养可能影响抗氧化能力的时间模式，但需进一步验证。
研究结论部分总结：该研究证明了在TIBs中建立皂树-马基莓种间共培养用于同时积累互补类次生代谢物的可行性。物种相对比例提供了调控SRM与PRM平衡的实用手段，ABA诱导引入了第二层调控。两种代谢物类别在液体培养基中的检测进一步突出了系统潜力，确定了可能的下游回收部分。1QS:2AC处理在30天培养期间ORAC能力增加，而马基莓对照下降，提示物种比例可能影响培养期间抗氧化能力的时间模式。总体而言，研究结果为可调谐的种间TIB平台建立了概念验证，其中物种组成与ABA诱导可用于调控两种智利植物物种的植物化学输出。然而，研究未建立共培养归因的生产力增强，也未证明过程的可扩展性与可持续性，需进一步整合色谱与代谢组学分析、物种特异性生长测量、延长培养时间及胞外代谢物定量研究。
