盐胁迫诱导除虫菊酯生物合成与ABA代谢协同调控的转录组与WGCNA整合分析——以除虫菊（Tanacetum cinerariifolium）为例

《Industrial Crops and Products》：Integrated transcriptomic and WGCNA analyses reveal coordinated regulation of pyrethrin biosynthesis and salt stress response in pyrethrum ( Tanacetum cinerariifolium)

　　

整合转录组学与WGCNA分析揭示除虫菊（Tanacetum cinerariifolium）中除虫菊酯生物合成与盐胁迫响应的协同调控 摘要：土壤盐渍化是全球农业面临的主要非生物胁迫之一，严重影响植物生长与作物生产力。除虫菊（Tanacetum cinerariifolium）作为一种经济价值极高的多年生草本植物，其头状花序富含天然除虫菊酯类化合物，广泛用作环境友好型杀虫剂。然而，盐胁迫如何影响除虫菊酯积累及其分子机制尚不清楚。本研究通过生理生化分析、转录组测序、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、qRT-PCR验证及除虫菊酯含量测定，系统探究了除虫菊在盐胁迫下的适应机制。结果表明，盐胁迫显著增强了叶片中除虫菊酯的积累，并诱导了抗氧化酶活性的组织特异性变化。WGCNA鉴定出MEyellow模块作为连接碳代谢、甲基赤藓醇磷酸（MEP）前体供应、脱落酸（ABA）相关代谢与除虫菊酯生物合成的核心调控模块，其中DXS（1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶）、ZEP（玉米黄质环氧酶）和ENO2（烯醇化酶2）被确定为关键枢纽基因。进一步分析表明，MEP途径作为代谢枢纽，在盐胁迫下同时服务于ABA相关代谢与除虫菊酯生物合成，并呈现“叶片合成、根系节约”的空间分工模式。本研究成果揭示了除虫菊响应盐胁迫的分子调控网络，为培育耐盐且高产除虫菊酯的除虫菊新品种提供了候选基因与调控靶点。

论文解读：盐胁迫诱导除虫菊酯生物合成与ABA代谢协同调控的转录组与WGCNA整合分析

一、研究背景与科学问题

土壤盐渍化是全球农业面临的严峻挑战，约20%的耕地和50%的灌溉面积受到盐胁迫影响。盐胁迫通过渗透胁迫、离子毒性和氧化胁迫等途径严重抑制植物生长与作物产量。植物在长期进化中形成了复杂的适应性机制，包括激素信号转导（尤其是脱落酸ABA）、抗氧化防御系统和次生代谢重编程。值得注意的是，在许多经济植物中，盐胁迫常导致生长抑制与次生代谢物积累之间的权衡，这种权衡不仅关乎植物逆境适应，也直接影响经济性状的形成。

除虫菊（Tanacetum cinerariifolium）是一种重要的经济草本植物，其花头富含天然除虫菊酯类杀虫成分，因其高效、广谱、低残留和不易诱发害虫抗性而被广泛应用于农业和公共卫生领域。已有研究表明，茉莉酸甲酯（MeJA）和ABA可诱导除虫菊酯生物合成基因的表达，如转录因子TcbZIP60和TcWRKY75正向调控除虫菊酯积累。然而，盐胁迫如何与除虫菊酯代谢建立联系，其分子调控机制仍不清楚。为此，研究人员开展了系统的转录组学与网络分析研究，旨在阐明盐胁迫下除虫菊酯积累的调控机理。

二、研究方法与技术路线

本研究采用的主要关键技术方法包括：（1）生理生化分析：测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量；（2）转录组测序（RNA-seq）：对叶片和根组织分别进行Illumina NovaSeq 6000双端测序，获得高质量转录组数据并进行从头组装；（3）加权基因共表达网络分析（WGCNA）：筛选表达量高且变异系数大的基因构建共表达模块，识别与盐胁迫和除虫菊酯积累相关的核心模块；（4）蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析：利用STRING数据库和Cytoscape软件识别枢纽基因；（5）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证：对14个候选枢纽基因进行表达水平验证。所有实验均设置三个生物学重复，样本来源于实验室保存的除虫菊‘No.39’品种。

三、主要研究结果

3.1 盐胁迫诱导除虫菊表型与生理指标的差异化响应

经14天NaCl处理后，100 mM NaCl处理植株生长相对正常，仅轻微叶片黄化；200 mM NaCl处理则出现叶片萎蔫和坏死。叶片中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性随盐浓度升高而递增，而过氧化物酶（POD）活性在对照条件下最高，100 mM时下降，200 mM时略有回升。丙二醛（MDA）含量在叶片中呈先降后升的双相响应，在根部则持续下降。这些结果表明，除虫菊通过组织特异性的抗氧化酶系统应对盐胁迫。

3.2 转录组测序质量与功能注释

共构建18个RNA-seq文库（叶片和根各3个处理×3个重复），每个文库获得超过3890万条高质量clean reads，Q30>97%。从头组装获得112,046个unigenes，平均长度1948 bp，N50为2205 bp。84.03%的unigenes在Nr数据库中获得注释，其中匹配度最高的物种为黄花蒿（Artemisia annua，68.17%）。主成分分析（PCA）和Pearson相关性分析显示样品间重复性好、数据可靠。

3.3 盐胁迫差异表达基因（DEGs）鉴定

叶片中共检测到16,940（CKL vs 100 L）、22,712（CKL vs 200 L）和24,123（100 L vs 200 L）个DEGs；根中分别为6,794、11,873和9,348个。韦恩分析显示叶片中有2665个共有DEGs，根中仅有661个。叶片中DEGs数量远多于根，表明叶片对盐胁迫的转录响应更为强烈。

3.4 盐响应DEGs的GO与KEGG富集分析

GO分析显示，共有DEGs富集于刺激响应、信号转导、转运活性和转录调控等功能类别。叶片中膜相关组分富集更显著，根中则更多富集于胞外区域和蛋白质复合体。KEGG分析表明，叶片中显著富集的通路包括能量代谢（145个基因）、防御相关通路（63个）、次生代谢物生物合成（58个）、萜类和聚酮代谢（41个）以及信号转导（54个）；根中则主要富集于防御相关通路（32个）和次生代谢物生物合成（28个）。

3.5 WGCNA模块构建与功能注释

基于15,000个过滤后的基因构建共表达网络，软阈值设为10，合并阈值为0.3，最终鉴定出8个共表达模块。其中黄色模块（MEyellow，含922个基因）与盐胁迫和除虫菊酯积累呈强正相关。GO富集显示该模块涉及代谢过程、刺激响应、催化活性和转录调控活性。KEGG富集显示该模块富集于环境适应、萜类和聚酮代谢、能量代谢、脂质代谢和信号转导等通路，表明MEyellow可能是耦合盐胁迫信号与除虫菊酯合成的关键调控模块。

3.6 枢纽基因鉴定

蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析识别出MEyellow模块中的枢纽基因，主要包括MEP途径的DXS和ISPE（4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶）、ABA生物合成的ZEP、碳代谢相关基因PGI1（磷酸葡萄糖异构酶1）、TKL-2（转酮醇酶2）和ENO2，以及参与脂质和氨基酸代谢的CAC2（乙酰辅酶A生物素羧化酶亚基）、ACS（乙酰辅酶A合成酶）和IPMS2（2-异丙基苹果酸合酶1）。组织特异性表达分析显示，DXS、ACS、ENO2、CAC2和IPMS2主要在根中表达，其余基因主要在叶片或均匀分布。

3.7 盐胁迫下ABA与除虫菊酯生物合成通路的整合分析

构建的整合代谢通路图显示，ABA和除虫菊酯两条合成途径共享质体MEP途径产生的异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）前体。ABA分支中，除TcNCED3外，其他基因在叶片中受盐胁迫显著上调；除虫菊酯分支中，多数基因在100 mM NaCl处理的叶片中表达量最高。茉莉酸（JA）生物合成基因TcLOX和TcAOC则在根中表达较高，呈现组织特异性。

3.8 关键基因表达与除虫菊酯含量验证

qRT-PCR验证了6个除虫菊酯生物合成基因（TcAOC、TcADH、TcCHH、TcMT、TcLOX、TcPYS）和4个ABA生物合成基因（TcABA2、TcAAO3、TcZEP、TcNCED3）的表达。结果显示，除虫菊酯合成基因在叶片中于100 mM NaCl时表达量最高，与除虫菊酯含量增加一致；ABA合成基因在叶片中随盐浓度递增而上调，在根中则呈下调趋势。

四、讨论与结论

讨论部分指出，除虫菊在盐胁迫下表现出中等耐盐性，通过有效激活抗氧化防御系统维持生理稳定。MEyellow模块中的枢纽基因DXS、ZEP和ENO2构成一条“能量-前体-激素”协同调控轴：ENO2增强糖酵解提供ATP，DXS驱动MEP途径供给萜类前体，ZEP促进ABA合成激活下游防御反应。该模块体现了“正激活与负反馈调谐”的协同调控模式，使除虫菊能够根据胁迫强度灵活调整代谢策略。

研究还发现，叶片和根在盐胁迫下呈现出明显的空间分工：叶片负责ABA和除虫菊酯的合成，根则采取“节约型”策略以降低能量消耗。这一组织特异性调控模式可能反映了菊科植物独特的代谢适应策略。

结论：盐胁迫触发了除虫菊协调的生理、转录和代谢重编程。叶片除虫菊酯积累显著增加，伴随抗氧化酶活性增强和ABA/除虫菊酯生物合成基因的组织特异性调控。网络分析鉴定出MEyellow模块作为连接碳代谢、MEP前体供应、ABA相关代谢和除虫菊酯生物合成的核心调控模块，其中DXS、ZEP和ENO2为关键枢纽基因。研究结果表明，MEP途径在盐胁迫下作为代谢枢纽，同时服务于ABA相关代谢和除虫菊酯生物合成。本研究为理解盐诱导的除虫菊酯积累机制提供了框架，并为培育耐盐高产除虫菊酯种质资源提供了候选靶点。